高效液相色谱仪的使用.pdfVIP

实验八 高效液相色谱仪的使用（示教） 一、实验目的 1.了解HPLC仪器基本结构,掌握实验仪器的一般使用方法； 2.加深对色谱分离原理的理解，掌握主要实验条件的选择； 3. 掌握保留时间初步定性和外标法的定量方法 二、实验原理 以液体为流动相的色谱法称液相色谱法，由经典液相色谱（柱层析、纸层析、薄层层析） 和气相色谱发展起来，采用高压液体作流动相并采用了新型固定相和连续自动检测系统，从 而大大提高了理论塔板数，具有快速、高效、高选择性等特点，特别适用于大分子量的高分 子化合物及离子型化合物的分离与分析。因此人们称这种新型的液相色谱为高速、高压或高 性能液相色谱（High Performance Liquid Chromatography），简称 HPLC。 HPLC 系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理系统等组成，如 图 8-1 所示，其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部件。 图 8-1 HPLC 仪结构 1）输液泵是 HPLC 系统中最重要的部件之一，有的仪器还有梯度洗脱装置、在线脱 气机。输液泵性能的好坏直接影响整个仪器的性能和分析结果的可靠性，为了延长泵的使用 寿命和维持其输液的稳定性，操作过程中应防止任何固体微粒和气泡进入泵体，流动相需要 先过滤和脱气，可采用 Millipore 滤膜（0.2µm 或 0.45µm ）等滤器和脱气装置，而且输液泵 的滤器应经常清洗或更换。输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力，否则会使高压密 封环变形，产生漏液。 2 ）进样器大都使用六通进样阀或自动进样器。一般HPLC 分析常用六通进样阀，其关 键部件由圆形密封垫（转子）和固定底座（定子）组成。六通阀的进样方法如图 8-2，有部 分装液法和完全装液法两种：①用部分装液法进样时，进样量应不大于定量环体积的 50% （最多75 ％），并要求每次进样体积准确、相同。此法进样的准确度和重复性决定于注射 器取样的熟练程度，而且易产生由进样引起的峰展宽。②用完全装液法进样时，进样量应不 小于定量环体积的 3~5 倍（最少 3 倍），这样才能完全置换定量环内的流动相，消除管壁效 应，确保进样的准确度及重复性。 图 8-2 六通阀进样原理 3 ）色谱柱是色谱系统的关键，决定组分分离的好坏，所以对色谱柱的要求是柱效高、 选择性好，分析速度快等。对于一般的分析只需 5000 塔板数的柱效；对于较难分离物质对 则可采用高达 2 万的柱子，因此一般 10~30cm 左右的柱长就能满足复杂混合物分析的需要。 使用最广泛的反相键合相是十八烷基键合相，即让十八烷基（C18H37— ）键合到硅胶表面， 又称 ODS(Octadecylsily)或 C18 。 4 ）检测器的作用是把洗脱液中组分的量转变为电信号。紫外检测器是HPLC 中应用最 广泛的检测器，灵敏度高，噪音低，线性范围宽。UV 检测器分为固定波长检测器、可变波 长检测器和光电二极管阵列检测器(DAD) 。使用过程中，要注意流动池内不能有气泡，避免 被污染，否则产生噪音或基线漂移及出现许多线状“峰”，一般灯源开启稳定20 至 30 分钟后， 才可进样分析。 5 ）数据记录处理系统也称色谱工作站，通过工作站可进行全系统的自动化控制，其用 途包括三个方面：①采集、处理和分析数据；②控制仪器；③色谱系统优化和专家系统。 高效液相分配色谱法有反相或正相色谱法两种分离模式。反相高效液相色谱法 （RP-HPLC ）应用最为广泛，据统计，它占整个 HPLC 应用的 80%左右。它是采用非极性 固定相（如C18 等）、极性溶剂（如甲醇等）作为流动相的一种分离模式，极性较强或亲水 的样品分子和反相柱中的固定相上的相互作用较弱，分配较少，因此随着流动相较快流出。 本实验采用 RP-HPLC 分离模式，以紫外检测器进行检测，待测样品中不同组分分子与固定 相作用力的大小不同而产生分离，结果以色谱峰的形式进行记录。 三、仪器与试剂 仪器： Agilent HP 1100 高效液相色谱仪；紫外检测器；定量环体积 20μl ；50μl 微量 注射器；超声波清洗器。 色谱柱： C18 或 C8 试剂：1．甲醇（HPLC 纯）；超纯水。 2 ．苯标准溶液；混合样品 四、色谱条件 流动相：甲醇:水=80: