RTPCR常见问题分析.pptVIP

问题九： 扩增产物滞留在加样孔中 有可能是由于模板量过高而导致PCR结果产生了高分子量的DNA胶状物。建议将第一链结果至少稀释100倍再进行二次扩增。 另外，在二次PCR时使用的退火温度如果比引物的Tm值低5℃，可以将退火温度适当增高或进行热启动以提高特异性 * RT-PCR常见问题分析 一 、 RT-PCR反应原理与方法 RT-PCR是将RNA反转录（RT）和以反转录产物cDNA为模板的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的DNA片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因的表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因cDNA序列等研究。 1 RT-PCR反应步骤： 第一，RNA提纯； 第二，RT逆转录； 第三，PCR聚合酶反应 2 RT-PCR方法 2.1 一步法：即反转录和PCR扩增在同一管内完成， 有助于减少污染，灵敏度更高 2.2 两步法：即反转录和PCR扩增分两步进行，首先从RNA模板反转录得到cDNA，得到的cDNA再进行一次或多次不同的PCR反应。 2.3 一步法与两步法区别： 一步法RT—PCR反应更加快速、灵敏，操作简便，污染率低，RNA二级结构减少，并且因为聚合酶有校正活性，从而降低