生物化学（工科）基因工程与蛋白质工程.pptVIP

图14-3 放射性探针检测法筛选 DNA重组体 ( 3 ) R 一环检测法RNA 通过取代与它序列一致的DNA 链，同相应的另一条DNA 杂交，被取代的DNA 链与杂交双链RNA 一DNA 可形成一个突环（泡状），称为R 一环。形成R 一环的条件是高浓度（70 % ）的甲酞胺溶液和接近DNA 变性的温度。在这种条件下，将RNA 及DNA 的混合物退火，RNA 便同双链DNA 分子中与它互补的序列退火而形成DNA 一RNA 杂交分子，因为DNA 一RNA 杂交分子比DNA 一DNA 分子更稳定，所以被取代的另一DNA 链就被排斥而呈单链状态。此方法用于筛选重组体时，在有利于形成R 一环的条件下，使待检测的纯化的质粒DNA ，在含有mRNA 的缓冲液中局部变性。如果质粒DNA 存在着与mRNA 探针互补的序列，mRNA 就会取代DNA 中一条链，而与另一链形成双链杂交分子，从而形成R 一环结构。然后在电子显微镜下观察，可直接观察到R 一环。这样便可检出重组体质粒DNA 。 ( 4 )免疫测定法只要一个克隆的目的基因，能够在宿主细胞中表达，合成出外源蛋白质，就可用免疫测定进行检测。免疫测定法分为放射性抗休测定法和免疫沉淀测定法。放射性抗体测定法是将在固体培养基上由菌落所产生的蛋白质，转移到硝酸纤维素膜上，再用相应的带有放射性标记（如125Ⅰ）的抗体进行反应，洗去非特异性吸附的放射性物质后，用放射自显影显示结果。免疫沉淀测定法是用一种特异抗体与外源基因表达产物蛋白质，在固体培养基上发生抗休抗原沉淀反应，根据沉淀物所产生的白色沉淀圈来加以检测。 3 ．表达― 外源DNA 在受体细胞中的转录和翻译 带有目的基因的载体转移到受体细胞成功并筛选出来后，最终目的是要目的基因在受体细胞中得以表达，产生具有功能性的蛋白质或肤。因为基因表达是在一定调节控制下进行的，外源基因在受体细胞中要能表达，必须满足一定的条件。特别是真核基因在细菌中的表达。比如，真核基因表达的启动子能不能被原核细胞RNA 聚合酶识别而进行转录；真核基因转录出的mRNA 是否具有核糖体结合位点，使翻译能顺利进行；翻译产生的蛋白质能否通过细胞膜而排出细胞；外源蛋白是否会被受体细胞中的蛋白酶降解而失活。总之，基因工程要达到最后目的取得功能蛋白，必须依赖于目的基因的有效转录和mRNA 正确的翻译及翻译后加工，如果这些环节中任何一个环节不能正确地进行，均可导致基因上程的失败。 第三节蛋白质工程 一、蛋白质工程的概念 二、蛋白质工程的一般技术 三、蛋白质工程的应用 一、蛋白质工程的概念 1 ．基因定点突变― 定做新蛋白质 2 ．蛋白质设计― 对天然蛋白质的修饰  1 ．基因定点突变― 定做新蛋白质 这是根据蛋白质结构研究，设计一个新蛋白质的氨基酸序列，通过修饰编码原蛋白质的DNA 序列，最后创造出新的蛋白质的技术。人们长期以来一直希望制造出比天然蛋白质性能更好的新的蛋白质。曾经采用多肤合成的方法从头合成蛋白质，但其局限性很大。虽然有几个成功的例了，但要合成更大的蛋白质是很难实现的，而人工合成的蛋白质并不一定能够折叠成天然蛋白质的构象。因此，受基因工程的启发，解决合成新蛋白质的捷径还得从DNA 分子水平入手。根据新设计的蛋白质的氨基酸序列，使DNA 在体外发生突变与重组，形成新的基因，然后利用基因工程技术，得到所需的蛋白质。这种对天然存在的结构进行有针对性的突变而产生有活性产物的过程，叫寡核背酸诱导的定点突变，简称定点突变（sitedirected mutagenesis ）。可见蛋白质工程是基因工程与蛋白质结构研究相融合的产物。它是在基因工程的基础上发展起来的，而且仍然需要基因工程的全套技术。从这点出发，故有人将蛋白质工程称为第二代基因工程。但二者也有明显的区别：基因工程要解决的问题是把天然存在的蛋白质通过克隆其基因大量地生产出来；而蛋白质上程则致力于对天然蛋白质的改造，制备各种定做的新蛋白质。 2 ．蛋白质设计― 对天然蛋白质的修饰 像建筑学家根据建筑力学的理论基础，可随意设计建造千姿百态的高楼大厦一样，生物化学和分子生物学家也可以按照蛋白质结构功能的理论基础，随意设计出各种各样的、比天然蛋白质性能优越得多的新型蛋白质。蛋白质的分子设计包括基于天然蛋白质结构的分子设计，即对天然蛋白质的分子修饰；蛋白质从头设计；蛋白质的功能设计和计算蛋白质设计。显然，这些设计均强烈地依赖于对蛋白质的一级结构、空间构象以及结构与功能关系的清楚了解。然而，直到现在从生物化学发展的水平来看，对这些知识的了解仍然是支离破碎的，缺乏系统的理论。因此，目前的蛋白质设计，主要是对天然蛋白质的修饰。 2 ．蛋白质设计― 对天然蛋白质的修饰 蛋白质设计一般具有下列步骤。 ① 选定欲研究的某一功能蛋白质后，为