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16S rDNA 鉴定细菌的方法 细菌 16S rDNA 鉴定主要分为 7 个部分： 1.提取细菌基因组 DNA, 2.设计/选择引物进行PCR 扩增，电泳检测纯度与大小。 3.琼脂糖凝胶电泳分离 4.胶回收目的片段 5. 目的片段测序。 6.BLAST 比对获取相似片段。 7.构建系统进化树 试剂： 1、培养基：通常选择组分简单且细菌生长良好的培养基（培养基组分过于复杂会影响 DNA 的提取效果，也可以在裂解细菌前用TE 缓冲液对菌体进行洗涤。）。 2、1M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0) （1L）：121.1g Tris，加浓盐酸约（70ml, 60ml, 42ml）， 高温高盐灭菌后，室温保存。冷却到室温后调 pH，每升高 1℃，pH 大约下降 0.03 个单位。 3、0.5M EDTA （pH8.0）（1L）：186.1g Na2EDTA•2H2O，用NaOH 调 pH 至 8.0 （约20g）,高温 高压灭菌，室温保存。 4、10×TE Buffer(pH7.4，7.6，8.0) （1L）：组分：100 mM Tris-HCl，10 mM EDTA。1M Tris-HCl （pH7.4，7.6，8.0）取 100ml，0.5M EDTA （pH8.0）取20ml。高温高压灭菌，室温保存。 1×TE Buffer 用 10×TE Buffer 稀释 10 倍即可。 5、10%SDS （W/V）：称 10g，68℃加热溶解，用浓盐酸调 pH 至 7.2。室温保存。用之前在65℃ 溶解。配置时要戴口罩。 6、5M NaCl：称 292.2gNaCl，高温高压灭菌，4℃保存。 7、CTAB/NaCl （10%CTAB，0.7M NaCl）：溶解4.1g NaCl，加 10g CTAB （十六烷基三甲基溴 化铵），加热搅拌。用之前在 65℃溶解。 8、氯仿/异戊醇：按氯仿：异戊醇=24：1 （V/V）的比例加入异戊醇。 9、酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）：按苯酚与氯仿/异戊醇=1：1 的比例混合 Tris-HCl 平衡 苯酚与氯仿/异戊醇。 10、TAE 缓冲液：使用液 1×：0.04 mol/L Tris-乙酸，0.001 mol/L EDTA。浓储存液 50×： 242g Tris，57.1 ml 冰醋酸，100 ml 0.5 mol/L EDTA (pH8.0)。 11、6×上样缓冲液（100 ml）：0.25%溴酚蓝（BPB），40%蔗糖，10 mmol/L EDTA (pH8.0) （0.2 ml），4℃保存。 12、0.6%琼脂糖凝胶：称取 0.3g 琼脂糖用 TAE 溶液配置 50 ml。 13、EB：10 mg/ml。称取 1g 溴化乙锭定容至 100ml。棕色瓶室温避光保存。EB 的工作浓度 为 0.5ug/ml。当配置 50ml 琼脂糖凝胶时加入 EB 为 2.5ul。（因EB 是剧毒物质，目前很多 实验室用生物荧光染料替代，常用的有 Gelred 等） 14、蛋白酶K：20 mg/ml 溶于水，-20℃保存，反应浓度 50 ug/ml，反应缓冲液：0.01 mol/L Tris (pH 7.8), 0.005 mol/L EDTA, 5% SDS，反应温度 37-56℃。无需预处理。 15、RNase A：10 mg/ml。25 mg RNase A 加 1M Tris （pH 7.5）25ul，2.5M NaCl 15ul， 无菌水 2460 ul，于 100℃加热 15 分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。（为避 免 RNA 的干扰，使用RNA 酶降解基因组中的 RNA。） 1.1 细菌基因组 DNA 提取 基本步骤： 材料准备 破碎细胞或胞膜—内容物释放 核算分离、纯化 沉淀或吸附核酸，并去除杂质 核酸溶解在适量缓冲液或水中 基因组 DNA 提取所需仪器：高速冷冻离心机、恒温冰箱、移液器、水平电泳槽、紫外/荧光 观测仪 细菌基因组 DNA 提取方法综述 细菌基因组 DNA 的提取方法主要有 5 种。不同的方法所选择的试剂会有所不同。 1 快速微量提取法  取 1.5ml 菌体培养物于一灭菌 Ep 管中，12000rpm 离心 1min, 丢去上清夜，收集菌体。  加入 400ul 裂解液（40mMTris-醋酸，20mM 醋酸钠,1mMEDTA,1%SDS,pH7.8）混匀,置于 o 37 C 水浴 1hr。  然后加入 2