两种新型结核分枝杆菌DNA疫苗pIHsp65GM和 pIHsp65-Esat6GM的构建及体外表达.pdfVIP

中文摘要中文摘要 中文摘要中文摘要 目的目的 目的目的 构建含结核分枝杆菌Hsp65 、Esat-6基因和免疫佐剂hGM-CSF共表达的两种新型DNA 疫苗pIHsp65GM和pIHsp65-Esat6GM ，转染HepG-2细胞并用分子生物学方法检测 Hsp65 、 Hsp65-Esat6和hGM-CSF蛋白的表达。 方法方法 方法方法 1.应用分子克隆技术，以结核分枝杆菌H37Rv株全基因组为模板扩增出Hsp65 ，产物经纯 化后与双顺反子真核表达载体pIRES进行重组，构建pIHsp65重组质粒。 2.同时以本实验室已构建的重组质粒pEGHsp65-Esat6为模板扩增出Hsp65-Esat6融合基因， 与双顺反子真核表达载体pIRES进行重组，构建pIHsp65-Esat6重组质粒。 3.以pORF-hGM-CSF 质粒为模板扩增出基因佐剂hGM-CSF ，将hGM-CSF 基因分别与 pIHsp65和pIHsp65-Esat6质粒进行重组，构建新型结核分枝杆菌Hsp65基因，Hsp65-Esat6 融合基因分别和hGM-CSF共表达DNA疫苗pIHsp65GM及pIHsp65-Esat6GM 。 4. 将pIHsp65GM 和pIHsp65-Esat6GM 分别转染HepG-2 细胞中，采用免疫组织化学方法和 Western-blot方法分别检测Hsp65和Hsp65-Esat6蛋白的表达；采用RT-PCR方法和ELISA方 法分别检测hGM-CSF mRNA和蛋白的表达。 结果结果 结果结果 1. PCR、酶切鉴定、测序等方法证实融合质粒pIHsp65GM 和 pIHsp65-Esat6GM 构建成功。 2. 免疫组织化学方法检测到Hsp65和Hsp65-Esat6表达阳性细胞；Western-blot方法证实在 HepG-2细胞内表达的Hsp65和Hsp65-Esat6分子量大小正确。 3. RT-PCR方法检测出pIGM 、pIHsp65GM 和pIHsp65-Esat6GM 转染组细胞均有hGM-CSF mRNA表达，三组细胞中hGM-CSF基因mRNA 的表达量差异无统计学意义(p ﹥0.05) 。 ELISA方法检测到pIHsp65GM和pIHsp65-Esat6GM转染组细胞培养上清中hGM-CSF 的表 达，且与空载体对照组比较差异均有统计学意义 (p 0.01). 结论结论 结论结论 I 成功构建了两种新型DNA疫苗pIHsp65GM和pIHsp65-Esat6GM ，为进一步研究该类新 型结核DNA疫苗在体内的免疫应答特点和免疫保护效果奠定基础。 关键词关键词 结核分枝杆菌 DNA 疫苗 Hsp65 Esat-6 hGM-CSF 关键词关键词 II Abstract Objective To construct two novel DNA vaccine pIHsp65GM and pIHsp65-Esat6GM of Mycobacterium tuberculosis H37Rv, then transfect to HepG-2 cells and detect protein expression of Hsp65、 Hsp65-Esat6 and hGM-CSF by molecular biology methods. Methods 1. To use the Whole–genome from Mycobacterium tuberculosis H37Rv as template to amplify Hsp65 gene by molecular cloning technique, then to recombine it with bicistronic eukaryotic expression vector pIRES after purification and c