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中国科技论文在线 融合蛋白EGFP-PPA 原核表达与标记肿瘤细胞研究1 李新，牛娜，李娜，陈磊，路巧然，席璐，李恭楚 浙江理工大学生命科学学院，杭州(310018) Email: lgc@ 摘 要：肿瘤细胞糖基化改变是非常普遍的现象，与恶性肿瘤的发生发展有着密切的关系。 掌叶半夏凝集素（Pinellia pedatisecta agglutinin ，PPA ）是一种甘露糖特异性结合凝集素， 与绿色荧光蛋白（EGFP ），通过分子技术形成融合基因，并在大肠杆菌中表达纯化了 EGFP-PPA 融合蛋白。实验结果表明，此融合蛋白可以识别实体肿瘤细胞表面的一部分，如 Hep3B 、 Hu7 、PLC 、BEL-7404 以及A549 ，而不能识别肝正常细胞L02 ，提示实体瘤细胞 表面显露的甘露糖残基被此融合蛋白所识别，说明 PPA 识别具有甘露糖表型的实体瘤细胞 表面的一部分，这些实验结果为进一步阐明甘露糖显露细胞在肿瘤的发生发展中的作用奠定 了基础。 关键词：糖基化；掌叶半夏凝集素；融合蛋白；甘露糖；肿瘤 1. 引言 引肿瘤细胞侵袭和转移是肿瘤重要特征之一，与肿瘤的恶性程度和肿瘤病人的预后有直 接关系[1,2] 。越来越多的证据表明，肿瘤细胞表面糖基异常化与肿瘤细胞的侵袭和转移有密 [3,4] 切关系，这些变化包括糖链在表达水平上的差异和特殊糖基结构的出现 。因此，研究细 胞膜表面糖蛋白及糖链结构变化对于解释肿瘤细胞的形成、发展与转移非常重要。植物凝集 素是一类存在于大多数植物中的蛋白质或糖蛋白。它的最大的特点在于它们能识别糖蛋白和 糖脂,特别是细胞膜中复杂结构的糖链：即细胞膜表面决定簇。掌叶半夏（Pinellia Pedatisecta ） 为天南星科半夏属植物，其块茎是中国的传统中药材，在我国已经有两千多年的药用历史， 其主要活性成分除活性多糖、生物碱、甾醇外，还有蛋白质，有燥湿化痰、降逆止呕、消痞 散结等功效[5] 。掌叶半夏凝集素是半夏总蛋白的重要组分之一，能专一结合甘露糖而不结合 葡萄糖，属于单子叶植物甘露糖凝集素家族[6] 。 本研究构建了 EGFP-PPA 原核表达载体，并表达纯化了该融合蛋白，研究掌叶半夏凝 集素对肿瘤细胞的识别作用，结果发现，EGFP-PPA 可以特异的结合肿瘤细胞，而不结合肝 正常细胞，表明PPA 可以特异的识别肿瘤细胞表面的甘露糖残基，从而为进一步的研究肿 瘤的发生发展以及浸润侵袭奠定了基础。 2. 材料与方法 2.1 材料与试剂 表达载体pET-28a (+) ，E.coli BL21(DE3) 由本实验室保存, pET-28a-PPA 为本课题组构 建。人肝癌细胞株 Hep3B 、Hu7 、PLC 、BEL-7404 ，人肺腺癌细胞株 A549, 人肝正常细胞 株 L02 均购自中科院上海细胞库，所有细胞在 5% CO2，37℃培养箱中培养，培养液为含 10% FBS 的DMEM，DMEM 购自GIBCO 公司。各种限制性内切酶、T4 DNA Ligase、DNA Marker 为TaKaRa 公司产品；IPTG 、预染蛋白Marker 、Taq polymerase、RNaseA 为Fermentas 公司产品；KOD-Plus 为Toyobo 公司产品；Ni-NTA His. Bind Resin 为MERCK/Novagen 公 1 本课题得到国家自然科学基金(No资助。 - 1 - 中国科技论文在线 司产品；胶回收试剂盒为Axygen 公司产品, BCA 蛋白浓度测定试剂盒为Pierce 公司产品。 2.2 方法 2.2.1 pET-28a-EGFP-PPA 重组表达载体构建 根据EGFP 基因序列，设计一对引物，并在上、下游引物中分别引入Nde I 和Xho I 酶 切位点，引物序列如下： EGFP-F 5′-GGAATTC