东北梅花鹿鹿茸尖端组织全长cDNA文库的构建.pdfVIP

第三部分 资源育种篇 东北梅花鹿鹿茸尖端组织全长cDNA 文库的构建 郝 丽 李和平* 严 历 （东北林业大学野生动物资源学院哈尔滨 150040 ） Construction of Velvet Tip Tissue Full-length cDNA Library of Sika Deer(Cervus nippon hortulorum Lydekke) HAO Li LI He-ping YAN Li (Northeast Forestry University Harhin 150040 ) 摘要：为克隆出与鹿茸生长发育相关基因的全长序列，采用 SMART 技术构建了东北梅花鹿鹿茸尖端组 织的全长 cDNA 文库。用 SV Total RNA Isolation System 试剂盒提取总 RNA，以逆转录酶PowerScriptTM 反转录合成第一链 cDNA，然后通过 LD-PCR 合成并扩增 ds cDNA。扩增产物经纯化、Sfi Ⅰ酶切、过 CHROMASPIN-400 柱去除小片段后，连接到 Sfi Ⅰ消化过的pDNR-LIB 质粒载体中，最后用电转化法将 重组质粒转化到 E.coli DH5 α内得到原始文库。经测定，构建的原始文库约含有 2.56 ×106 个重组 子，插入片段多在 0.5～2 kb 之间，平均插入片段长度约 1.1 kb，重组效率接近 100%。结果表明， 东北梅花鹿鹿茸尖端组织的全长cDNA 文库已构建成功。 关键词：东北梅花鹿；鹿茸；全长cDNA 文库；SMART 技术； 东北梅花鹿(Cervus nippon hortulorum Lydekke)是鹿科(Cervidae)、鹿属(Cervus)动物梅花鹿(Cervus nippon Temminck) 的东北亚种，以其茸质优良而著称。鹿茸为雄鹿(驯鹿除外)未骨化密生茸毛的幼角。 梅花鹿鹿茸含有多种生理活性物质，具有广泛的药理作用，为盛誉国内外的常用名贵滋补品和中药材。 哺乳动物骨组织的生长是一个非常缓慢的过程，而鹿茸作为特殊的骨组织，在快速生长期可达2 厘米 /天，是哺乳动物任何组织和器官无法比拟的。由此，许多学者推测，鹿茸的快速生长有它特殊的物 质基础，其生长发育存在自身的生长规律。所以，鹿茸成为了研究哺乳动物细胞发生、生长与分化的 理想材料，可作为模拟人和动物软骨内成骨过程的最佳实验模型。大量的研究已证明，鹿茸的生长分 化中心位于其尖端，该处组织是生长因子和其它很多活性成分含量较高的部位，因此，实验所用鹿茸 样品多选择鹿茸的顶端。近年来，国内外许多学者针对鹿茸化学成分及其药理作用、茸角的组织学结 构、鹿茸发生的生化生理机制、控制鹿茸形成的内分泌、神经与激素调节机制以及鹿茸产品粗加工等 方面进行了研究。但有关鹿茸的分子遗传学背景资料仍然缺乏，尚未见到有关鹿茸生长发育特异基因 及其调控机制的研究报道。随着分子生物学技术的发展和人类基因组计划的实施，一系列寻找新基因 的方法也应运而生，而在众多方法中，能得到完整的基因序列，比较可行和可靠的主要还是cDNA 文 库筛选。笔者利用SMART 法构建了东北梅花鹿鹿茸尖端组织的全长cDNA 文库，一方面为保存梅花 鹿这一珍贵物种的基因资源，另一方面为鹿茸生长发育相关基因全长序列的克隆及其内在分子机制的 研究奠定基础。 第三部分 资源育种篇 1 材料 动物组织：试验选取人工驯养的一头健康4 岁成年东北梅花鹿为试验动物，在其生茸至二杠茸型 时采集茸顶端组织为试验样品。取样时，将鹿麻醉，用手术刀迅速切取鹿茸顶端约4 厘米组织(图1)， 用酒精棉擦去茸皮表面污物，对照文献对赤鹿生长顶端的分层方法(图 2) ，切取真皮层、间充质层、 前软骨层和软骨层组织各25 毫克，总共100 毫克，于液氮保存。 图1 鹿茸顶端切害示意图 图2 鹿茸生长顶端组织结构层次示意图 D.皮肤层；RM. 间充质层；PC.前软骨层；TZ.过渡层；C 软骨层。 主要试剂：CreatorTMSM