抗FLAG标签单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用.pdfVIP

维普资讯 中国生物工程杂志 ChinaBioteehnology，2006，27(1)：93～97 抗 FLAG标签单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用 闵玉涛 王云龙 李晨阳 李玉林 王 真 (1郑州轻工业学院 郑州 450002 2河南省生物工程技术研究中心 郑州 450002) (3郑州职业技术学院 郑州 450121) 摘要 碳化二亚胺法合成FLAG，BSA完全抗原，利用杂交瘤技术制备5株分泌抗FLAG标签单克 隆抗体的杂交瘤细胞株。制备腹水，并对其进行纯化、分析和鉴定。制备交联抗FLAGmAb亲和 层析柱，纯化带FALG标签的融合蛋白，经SDS。PAGE电泳后薄层扫描分析纯度，用Western— blotting检测mAb对融合蛋白的反应性。结果表明：5株细胞分泌的单抗都为IgG类型、IgG。亚 类，腹水效价均高于1：10，且5株单抗与其它融合蛋白标签无交叉反应性；亲和层析纯化后蛋白 纯度达85％以上，5株单抗均可用于融合蛋白的Western—blotting检测，建立了可用于 FLAG融合 蛋 白纯化和检测方法。 关键词 FLAG标签 单克隆抗体 免疫亲和层析 中图分类号 Q819 FLAG是由8个氨基酸 (Asp-TyrL·ys—Asp—Asp—Asp— Gibco产 品。卡介苗购 自兰州生物制 品研究所、 Asp—Lys)组成的短肽，专门设计用于融合蛋 白质的免 PEG2000为Merck公司产品。其它化学试剂均为分析 疫吸附纯化。利用FLAG标签可以建立一个基于融合 纯。96孔细胞培养板和24孔细胞培养板均为NUNC 多肽的高效检测和纯化系统。FLAG标签结构短小，且 产品。 与融合蛋白质之间含有一个肠激酶切割位点，可以通 1．1．2 仪器 磁力加热搅拌器 (Coming公司，Pc． 过肠激酶切割除去…。FLAG抗原标签技术具有简单、 420)；酶标仪(MULTI2SKANMK3，Thermo)；CO2培养 方便的优点，但是，目前商品化抗 FLAG标签蛋白的单 箱(Forma公司，3326型)；硝酸纤维索膜 (NC膜) 克隆抗体(mAb)种类不多，且多需从国外进口，价格 (Amersham公司)；SDS—PAGE电泳仪 (BIO—PAD公 十分昂贵。因此，研制出抗 FLAG单克隆抗体。在融合 司)。 蛋白质的免疫吸附分离纯化中具有广阔的应用前景。 1．1．3 试验动物 BALB／c纯系雄性小鼠购 自中国医 1 材料与方法 学科学院动物研究所，鼠龄6～8周，体重 18—22g，用 于免疫和制备饲养细胞；5月龄雌鼠用于制备腹水。 1．1 材 料 1．2 方 法 1．1．1 试剂 FLAG8肽(西安蓝晶生物科技有限公 1．2．1 人工抗原的合成 (1)免疫原的合成 称取2 司合成)；牛血清白蛋 白(BSA，Sigma公司)；卵清 白蛋 mgFLAG和 3．2mgBSA溶于 450 PB(0．05mol／L， 白(OVA，Sigma公司)；HRP标记的羊抗鼠IgG由河南 pH7．0)中，溶解混匀后，将85 含有 1．2ragEDC的 省生物工程技术研究中心提供。PRMl1640培养基、 PB溶液逐滴加入，边滴入边搅拌，置磁力搅拌器上搅拌 HAT、HT、福氏不完全佐剂、兔抗小鼠Igc、IgG1、IgG2a、 反应4h，保持4℃冰浴，4℃静置过夜，用0．01mol／L， Ig