疼痛相关融合基因的构建及siRNA对其抑制作用的研究.pdfVIP

军 医 进 修 学 院 学 报 Acad J Chinese PLA Postgrad Med Sch 2009 Jun, 30（3） ·351· 基础研究 疼痛相关融合基因的构建及siRNA 对其抑制作用的研究 陈　娜，冯泽国，张　 ，李冠华，王　维 （解放军总医院　麻醉科，北京　100853） ： ［摘要］　目的 通过构建用于 RNAi 筛选的模拟靶基因，筛选出起作用的 siRNA，为进一步研究以 Cav2.2 e ［37a］ 为靶标的基因治疗提供依据。方法 ：构建了 EGFP-e37a/e37b 融合基因，将其放入载体质粒中进行表达。按照 siRNA 的设计原则设计了四对 siRNA （编码为 I 号、II 号、III 号、IV 号） ，并将其放入质粒表达载体中，用 siRNA 表达 载体与融合基因表达载体共转染 BHK 细胞进行了 RNAi 试验。用荧光显微镜、流式细胞仪等方法检测 RNAi 效 果。结果 ：EGFP-e37a/e37b 融合基因通过 PCR、测序等方法鉴定为正确 ；在荧光显微镜下可见 siRNAII 使细胞 的荧光效率明显受到抑制，流式细胞术可见 siRNAII 的 RNAi 效率在 24h 达到了 90% 左右，其余 3 条 siRNA 抑 制作用不明显。结论 ： 本研究将目的基因 e37a 与 EGFP 基因进行了融合构建，通过 EGFP 的绿色荧光效应显示 目的靶基因在细胞内的表达，并观察到 RNAi 抑制效果，筛选出了有功能的 siRNA。 ［关键词］siRNA ； RNAi ； 钙通道，N 型 ； Cav2.2 e ［37a］ ［中图分类号］R 34　　［文献标识码］A　　［文章编号］1005-1139 （2009） 03-0351-03 Construction of pain-related fusion gene plasmids and inhibitory effect of small interfering RNA CHEN Na, FENG Ze-guo, ZHANG Yu, LI Guan-hua, WANG Wei (Department of Anesthesiology, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China) Corresponding author:FENG Ze-guo. Email:beijing301@ ABSTRACT Objective: ［ ］　 To study the inhibitory effects of small hairpin RNA （shRNA ）expression vector on expression of the Cav2.2e ［37a ］gene. Methods: Expression plasmid EGFP-e37a/e37b was constructed. BHK cell line was co-transfected with the expression plasmid EGFP-e37a and level of EGFP-e37a fusion protein was quantified by fluorescent microscopy and fluorescence activated cell sorting （FACS ）. Results: The clones were identified by PCR and DNA sequence analysis. The results were shown as expected. siRNAII could inhibit 90% of EGFP-e37a expression. Conclusion: The EGFP-e37a/e37