EpCAM蛋白的表达、纯化及其单克隆抗体的制备.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１２，３２（５）：１９２３ ＥｐＣＡＭ蛋白的表达、纯化及其单克隆抗体的制备 孔　娟　高慧萍　张鹏伟　石必枝　蒋　华　严　瑾　李宗海 （上海交通大学医学院附属仁济医院上海市肿瘤研究所癌基因与相关基因国家重点实验室　上海　２０００３２） 摘要　目的：原核表达ＥｐＣＡＭ蛋白并制备抗ＥｐＣＡＭ特异性单克隆抗体，初步鉴定相应单克隆抗 体的特性。方法：ＰＣＲ扩增ＥｐＣＡＭ基因胞外区，将目的基因亚克隆至载体ｐＥＴ２８ａ（＋），转化至 大肠埃希菌株ＢＬ２１，ＩＰＴＧ诱导表达，组氨酸亲和层析法纯化表达产物。纯化蛋白免疫ＢＡＬＢ／ｃ 小鼠，将成功免疫的小鼠脾细胞与骨髓瘤 ＳＰ２／０细胞融合，经ＥＬＩＳＡ筛选得到分泌特异性抗 ＥｐＣＡＭ的单克隆抗体的细胞株，免疫 ＢＡＬＢ／ｃ小鼠进一步制备相应的单克隆抗体，并通过 Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ（蛋白质印记）和ＦＡＣＳ（流式细胞分析）鉴定单抗的特异性及生物学活性。结果：成功 构建重组表达载体ｐＥＴ２８ａＥｐＣＡＭ并在大肠杆菌中获得表达，经Ｈｉｓｔａｇ亲和层析法获得纯化的 ＥｐＣＡＭ重组蛋白。ＥｐＣＡＭ重组蛋白免疫的ＢＡＬＢ／ｃ小鼠的脾细