膜反向斑点杂交法检测广东人G6PD基因6种常见突变.pdfVIP

第32卷 第4期 中山大学学报(医学科学版) Vo1．32 No．4 2011年 7月 JOURNALOFSUNYAT-SENUNIVERSITY(MEDICALSCIENCES) Ju1． 2011 膜反向斑点杂交法检测广东人G6PD基因6种常见突变 郑卫东 。，张太松 ，陈 冬 ，葛艳芬 ，林 婷 ，胡 斌 (1．广东省人民医院／／广东省医学科学院 病理医学部检验科 ；2．中山大学达安基因诊断中心，广东 广州 510080) 摘 要：【目的】探讨膜反向斑点杂交法在广东人G6PD基因6种常见突变同步检测中的应用。方【法】用高铁血红蛋白 还原试验和G6PD／6一PGD酶活性 比值法进行 G6PD缺乏症筛查。应用多重 PCR方法扩增G6PD基因目的片段。用Premier Primer6．0软件设计和优化针对广东人常见6种 G6PD基因突变型的特异性寡核甘酸探针．用乙基一3一二甲氨基丙碳二亚胺 (EDC)法处理尼龙膜并固定探针 ，制成 G6PD基因突变检测用膜条。多重 PCR扩增产物与固定在膜条上寡核苷酸探针进行 杂交，通过显色反应判读结果。以G6PD基因测序为金标准，对膜反向斑点杂交法进行评价。 【结果】26例标本中膜反向斑 点杂交法检测结果 ：95A—G突变型5例 ，1024C-~T突变型3例，1376G—T突变型8例，1388GA突变型7例。392G—T 突变型 1例，未发现 1311c—T突变型，有两例检测为阴性。膜反向斑点杂交法未能测出的2例标本经基因测序证实存在 392G—T突变，其余 24例膜反向斑点法与基因测序法的结果完全一致，符合率为92．3％(24／26)。 【结论】在优化探针设计 和杂交条件前提下 ，膜反向斑点杂交法可用于广东人 G6PD基因6种常见突变型的同步检测。 关键词 ：葡萄糖一6一磷酸脱氢酶；基因突变 ；反 向斑点杂交法 (RDB) 中图分类号：R555 文献标志码：A 文章编号 ：1672—3554(2ffl1)04—0463～04 DetectionofSixCommonMutationsofCantoneseG6PD GenebyRDBAssay ZHENGWei-dong，ZHANGTai—song，CHENDong，GEYan—fen ，LINTing，HUbin (1．DepartmentofPathologyandLaboratoryMedicine，GuangdongGeneralHospital／／Guangd0ngAcademyofMedicalSciences， Guangzhou510080，China；2．DaanCenterofGeneticsDiagnosis，SunYat—senUniversity，Guangzhou510080，China) Abstract：O【bjective】Toexploretheapplicationofreversedotblotting(RDB)assayinthesimultaneousdetectionofthemost commonsixCantoneseG6PDgenemutations．M【ethods】Glucose6phosphatedehydrogenase(G6PD)deficiencywasscreenedusing themethemoglobinreductiontestandG6PD／6一PGDratiomethod．MuhiplexPCRwasusedtoamplifytheobjectivefragmentsofG6PD gene． ThespecificoligonucleotideprobesweredesignedandoptimizedusingthePremierPrimer6．0program．Nylonmembranewas treatedby (ethyl一3一(dimethylaminopropy1) carbodiimide，EDC) andthenwasdottedwiththespecifichybridizationprobes．The genotypeswerejudgedbycolorimetricreactionaftertheRDB．Moreover，theRDBas