心脏发育候选基因PYG01RNAi逆转录病毒载体系统的构建与鉴定.pdfVIP

第21卷第 6期 激 光 生 物 学 报 VoI_20 No．6 2012年 12月 ACTA LASER BIOLOGY SINICA Dec．2O12 doi：10．3969／j．issn．1007-7146．2012．06．010 心脏发育候选基因PYGO1RNAi逆转录病毒 载体系统的构建与鉴定 刘 明 ，刘宪楚 ，周军媚 ，谢华平 ，廖四芳 ，宋 文 ，李佑锋。，吴秀山 ，王跃群 (1．湖南师范大学生命科学学院心脏发育研究中心，湖南 长沙410006； 2．南华大学药学与生命科学学院，湖南衡阳421001) 摘 要 ：利用RNA干扰技术构建PYGO1基因RNA干扰 (RNAi)的真核表达质粒(pSUPER—PYG01)。首先，针 对 PYGO1cDNA序列设计并化学合成一对编码短发夹RNA序列 ，经退火插入到由Bgl11和XhoI酶切的pSU— PER质粒上构建重组RNAi质粒pSUPER—PYGO1。通过 XbaI酶切鉴定及测序分析验证构建效果，将正确构建 的质粒转染大鼠心肌细胞系H9c2建立产生逆转录病毒 的细胞克隆。通过 RT—PCR和Westernblot检测 pSU— PER—PYGO1对 H9c2细胞中PYGO1mRNA和PYGO1蛋白的干扰效果。pSUPER—PYGO1质粒经酶切鉴定及测序 分析，发现59nt寡核苷酸成功插入到预计位点，且序列完全一致；RT—PCR和Westernblot检测结果显示转染 pSUPER—PYGO1的细胞中PYGO1mRNA和PYGO1蛋白量明显降低。因此，靶向PYGO1的pSUPERRNAi载体 构建成功 ，为进一步从分子水平探讨PYGO1在心脏发育中的功能奠定了基础。 关键词 ：PYGO1基因；RNA干扰；pSUPER；H9c2 中图分类号：Q78 文献标识码 ：A 文章编号：1007-7146(2012)06-0528-04 C0nstructi0nandIdentificationofRNAiRecombinantRetroviralVectors Expression siRNA forHeartDevelopmentalCandidateGenePlGD1 LIUMing ，LIUXianchu，ZHOUJunmei一，XIEHuaping，LIAOSfiang ， SONG Wen ，LIYo ， Xiushan ，WANG Yuequn (1．TheCenterforHeartDevelopment，CollegeofLifeSciences，HunanNormalUniversity，Changsha410006，Hunan，China； 2．CollegeofPharmacyandLifeScience，UniversityofSouthChina，Hengyang421001，Hunan，China) Abstract：TheeukaryoticexpressionvectorofpSUPER—PYGO1thatcaninhibitPYGO1geneexpressionwasconstrue— ted．Firstly，apairofoligonucleotidescodingforshorthairpinRNA targetinggenePYGO1werechemicallysynthesized， thenannealedandinsertedintopSUPERplasmidsdigestedwithBglIIandXhoI toconstructtherecombinantRNAi plasmidpSUPER—PYGO1．RecombinantpSUPER—PYGO1plasmidwasidentifiedbyenzymedigestionandsequencinga— nalysis．TheH9c2cellsweretransfecte