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实验三 肝组织核酸的分离 实验目的 验证核酸的分子组成，掌握核酸部分组分的鉴定方法。 二.实验原理 组织细胞中的核酸（RNA和DNA）大部分以核蛋白的形式存在，遇酸（三氯醋酸）后核酸和蛋白质均被沉淀下来，弃去上清液。沉淀中的核酸又可溶于热的10％NaCl(生成核酸钠)，而蛋白质不溶，再弃去沉淀，在上清液中加入乙醇使核酸钠以沉淀形式析出。 RNA与DNA均可被硫酸水解成：磷酸、有机碱（嘌呤碱和嘧啶碱）及戊糖（核糖或脱氧核糖），这三类化合物可用下述方法鉴定。 磷酸与钼酸銨作用生成磷钼酸，后者在氨萘酚磺酸作用下生成蓝色的钼蓝。 嘌呤碱与硝酸银产生灰褐色的嘌呤银化合物。 核糖经浓硫酸脱水生成糠醛，后者再与地衣酚（3,5-二羟基甲苯）缩合成绿色化合物。 脱氧核糖经浓硫酸脱水生成ω-羟基-γ-酮基戊醛，它与二苯胺作用生成蓝色化合物。 实验方法及步骤 1.制备肝匀浆：将 1只小白鼠用拉断颈椎的方法处死，剖腹取出全部肝组织，用清水洗净血污，并用滤纸吸干，然后用剪刀剪碎，加0.9％NaCl溶液2ml于研钵中制成匀浆。 2.提取核酸：将全部匀浆置于小试管中，加入2％三氯醋酸2ml，用玻棒搅匀，静置3分钟。然后离心（3000r/min）3分钟，弃上清液，于沉淀中加入10％NaCl溶液2ml，充分混匀，置沸水浴中加热8分钟，用玻棒边加热边搅拌（防止玻管底破裂），使之充分生成核酸钠。取出放冷，离心（3000r/min）3分钟。将上清液倒入另一试管内，逐滴加入95％冷乙醇2ml，边加边搅拌，待析出白色沉淀。静置5分钟后，再离心（3000r/min）5分钟，倾去上清液，留沉淀备用。 3.水解核酸：在上述沉淀（核酸钠）中加入5％H2SO4 4ml，用玻璃棒搅匀，在沸水中加热10分钟，即得核酸水解液。 实验五 SDS－PAGE测定蛋白质的相对分子量 一. 实验目的 学习聚丙烯酰胺凝胶电泳技术 二. 实验原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高分辨率，用它分离、检测蛋白质混合样品，主要是根据各蛋白质各组分的电泳迁移率的不同。这种差异就蛋白质分子本身而言，主要与其所带净电荷以及分子量和形状有关。当电泳体系中含有一定浓度的十二烷基硫酸钠（SDS）时，则得电泳迁移率的大小只取决于蛋白质的分子量，从而可直接由电泳迁移率推算出蛋白质的分子量。 SDS的作用原理在于，这种阴离子去污剂能够与蛋白质结合，破坏蛋白质分子部、分子之间以及与其它物质分子之间的非共价键,使蛋白质变性而改变原有的空间构象。当有强还原剂（如巯基乙醇）存在时，可使蛋白质分子内的二硫键被彻底还原。并且当SDS的总量为蛋白量的3～10倍且SDS单位浓度大于1mol./L时，这两者的结合是定量的，大约每克蛋白质可结合1.4克SDS。蛋白质分子一经结合了一定量的SDS阴离子，所带负电荷的量远远超过了它原有电荷量，从而消除了不同种类蛋白质间电荷符号的差异。且由于分子量越大的蛋白质结合的SDS越多，所带负电荷也越多，这就使各蛋白质-SDS复合物的电荷密度趋于一致。同时，不同蛋白质的SDS复合物形状也相似，均是长椭圆状。因此，在电泳过程中，迁移率仅取决于蛋白质-SDS复合物的大小，也可以说是取决于蛋白质分子量的大小，而与蛋白质原来所带电荷量无关。据经验得知，当蛋白质的分子量在17,000～165,000之间时，蛋白质-SDS复合物的电泳迁移率与蛋白质分子量的对数呈线性关系：lgMW=lgK－bm， 　　　　　　　　　　　　　　　　　 上式中，MW为蛋白质的分子量，m为相对迁移率，K为常数，b为斜率。将已知分子量的标准蛋白质在SDS -聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率对分子量的对数作图，即可得到一条标准曲线。只要测得未知分子量的蛋白质在相同条件下的电泳迁移率，就能根据标准曲线求得其分子量。 三. 实验方法及步骤 1．按图安装制胶模具 2．根据所测蛋白质的相对分子量范围，选择某一合适的分离胶浓度。按下表所列的试剂用量配。 分离胶的配制 7.5%(ml) 10%(ml) 15%(ml) H2O 4.90 4.10 2.40 30%丙烯酰胺 2.50 3.30 5.00 分离胶缓冲液(pH8.8) 2.50 2.50 2.50 10% SDS 0.10 0.10 0.10 TEMED 0.02 0.02 0.02 10%过硫酸铵 0.02 0.02 0.02 总体积 10ml 10ml 10ml 将分离胶混匀后立即灌注于玻板间隙中，上层小心覆盖一层正丁醇。将胶板垂直放于室温下，待分离胶聚合完全后，倾去正丁醇并用滤纸吸干。 3．浓缩胶的制备 按下表配制浓缩胶，将浓缩胶混匀后直接灌注在已聚合