四膜虫rDNA表达载体的改造及用于异源基因的高效表达Modification.pdfVIP

基因组学与应用生物学，2013 年，第32 卷，第4 期，第548-556 页 Genomics and Applied Biology, 2013, Vol.32, No.4, 548-556 技术改进 Upgraded Technology 四膜虫rDNA 表达载体的改造及用于异源基因的高效表达 1 2 1 1* 袁冬霞 冯立芳 熊杰 缪炜 1 中国科学院水生生物研究所, 水生生物多样性与保护重点实验室, 武汉, 430072; 2 浙江工商大学食品与生物工程学院, 杭州, 310012 * 通讯作者, miaowei@ihb.ac.cn 摘 要 基于四膜虫小核rDNA 改造得到的pD5H8 载体，在转染进接合生殖时期的四膜虫后能发育成9 000~ 10 000 拷贝的大核rDNA，因此pD5H8 载体是四膜虫异源基因表达的研究热点；但其载体上匮乏合适的克隆位 点和无启动子结构阻碍了该载体的进一步发展。本研究在四膜虫启动子 -和终止子 -之间，通 HSP70 2 HSP70 1 过稀有酶切位点 - 导入细菌绿色荧光蛋白(HGFP)这一筛选标记，由此组成的DNA 片段(HSP70-2 5' UTR- I Sce Ⅰ I-Sce -HGFP-I-Sce -HSP70-1 3' UTR)整合进pD5H8 ，将之改造成pD5H8-HGFP 表达载体。来自真核生物 Ⅰ Ⅰ 的绿色荧光蛋白(GFP)藉由 - 酶切位点一步导入pD5H8-HGFP 表达载体后，在四膜虫中大量表达且具有 I Sce Ⅰ 生物学活性。因此，改造后的pD5H8-HGFP 表达载体拥有一步法引入异源基因，几乎无酶切位点的限制，有效的 筛选标记，高效的异源基因表达能力，以及环境友好、便捷可控等诸多优点，这对于深入开展四膜虫基因功能的 过表达研究和开发异源基因在四膜虫这一真核表达系统中的应用奠定了技术基础。 关键词 四膜虫, rDNA, pD5H8, pD5H8-HGFP, 异源基因表达 Modification of Tetrahymena rDNA Expression Vector Used for Efficient Expression of Exogenous Gene Yuan Dongxia 1 Feng Lifang 2 Xiong Jie 1 Miao Wei 1* 1 Key Laboratory of Aquatic Biodiversity and Conservation, Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan, 430072; 2 College of Food Science and Biotechnology, Zhejiang Gongshang University, Hangzhou, 310012 * Corresponding author, miaowei@ihb.ac.cn DOI: 10.3969/gab.032.000548 Abstract Vector of pD5H8, modified from rDNA of Tetrahymena small nuclear, can develop into rDNA of large nuclear with 9 000~10 000 copies after introducing into conjugation cells, which make it to be an ideal expression vector of exogenous genes. However, both insufficient appropriate clone sites and lacking promoter region hinder the further application of pD5H8. In this study, a bacterium green f