谷丙转氨酶活性的鉴定及活力单位的测定.docVIP

谷丙转氨酶活性的鉴定及活力单位的测定 一、[实验目的] 1.用纸层折法观察肝脏丙转氨酶ALT的转氨作用； 2.用分光光度法测定血清丙转氨酶的活力； 3.学习治疗检测SGPT的方法及原理； 4.了解检测肝损伤模型的制备及SGPT在科研中的应用。 二、[仪器与试剂NaCl溶液 （2）海砂 （3）1%谷氨酸溶液（1%KOH溶液中和） （4）1%丙酮酸钠溶液（用1%KOH溶液中和） （5）0.1%KHCO3溶液 （6）0.025%一溴乙酸溶液（用1%KOH中和） （7）2%乙酸溶液 （8）酚的饱和水溶液：将2份酚和2份水（按重量计算）混合，放入分液漏斗中，振荡。静止24h以后分层，将下部酚层放入瓶中备用。新配制的酚展层剂可以反复使用1周。 （9）0.1%水合茚三酮的正丁醇溶液 （10）0.1%标准谷氨酸溶液 （11）0.1%标准丙氨酸溶液 （12）1%KOH溶液 谷丙转氨酶活性的鉴定（纸层析法） 一、[实验原理] 观察肌肉糜中谷丙转氨酶所催化的氨基移换反应。通过纸层析法检查底物谷氨酸的减少和产物丙氨酸的生成。为防止丙酮酸被肌肉糜中的其它酶所氧化或还原，在反应系统中加入了抑制剂溴乙酸。 二、[实验操作] 1.谷丙转氨酶提取液制备：2g肝脏+0.9%NaCL 6mL+海砂 200mg，在低温下，研磨成浆，用稀薄的脱脂棉过滤，得提取液（滤液不清）。 2.转氨作用 取试管2支，按下表加入试剂，加入试剂的单位为mL 试 剂 对照管 测试管 1%谷氨酸 0.50 0.50 1%丙酮酸钠 0.50 0.50 0.1%KHCO3 0.50 0.50 0.025%一溴乙酸（可不加） 0.25 0.25 煮沸的酶液 0.50 — 酶液 — 0.50 加脱脂棉塞，45℃水浴，1.5h，时时振荡内容物 2%乙酸 6滴 6滴 沸水浴2min，使蛋白质完全沉下，过滤，作层析 3.纸层析操作方法 取圆形层析滤纸1张，在圆心处用圆规绘出直径为3cm的同心圆（滤纸不可以折），通过中心将滤纸绘成四等分扇形。用毛细管点样2-4次（直径不超过2mm），在滤纸的圆心上剪一小孔，直径约1-2mm，取一小滤纸条，将下端剪成刷状，在卷成灯芯插入圆形小孔，不能使灯芯突出纸面，将圆形滤纸平放在盛有层析液（水饱和酚）培养皿上，使灯芯向下与溶剂接触，用大小相同的培养皿盖在滤纸上，溶剂通过灯芯上升到滤纸上向四周展层，直到溶剂前沿移至距滤纸边缘约1cm处时停止（展层时间为1h），80-100℃烘箱干燥，喷洒水合茚三酮的正丁醇溶液，80-100℃显色。 三、[实验结果] 实验 血清谷丙转氨酶活力单位测定 一、[实验原理] 本实验用丙氨酸和α-酮戊二酸为底物，经转氨作用生成谷氨酸和丙酮酸。丙酮酸与2，4-二硝基苯肼作用生成2，4-二硝基苯腙，此物质碱性条件下呈棕红色，其颜色的深浅与丙酮酸的含量成正比，可用比色法进行定量测定。通过与标准溶液的比较，即可计算出酶的活力单位。 二、[实验试剂] （1）1/15mol/L pH=7.4的磷酸缓冲液：取1/15 mol/L磷酸氢二钠（称取Na2HPO4 9.47g或Na2HPO4·12H2O 23.87g，溶于蒸馏水中定容至1000mL）825mL；1/15 mol/L磷酸二氢钾（称取KH2PO4 9.078g溶于蒸馏水中定容1000mL）175mL混合。 （2）GPT基质液：称α-酮戊二酸，29.2mg（2μmol/L）及α-DL-丙氨酸1.78g（200μmol/L）mg，溶解于10mL浓盐酸中，以蒸馏水定容至100mL。 （4）2μmol/mL丙酮酸钠标准液：精确称取丙酮酸钠22mg，加磷酸缓冲液溶解后，定容至100mL。临用前配制。 （5）0.4mol/LNaOH溶液 三、[实验操作] （一）标准曲线的绘制 试管 试剂 测定管 空白管 1 2 3 4 5 2μmol/mL丙酮酸钠标准液 （mL） — 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 GPT基质液（mL） 0.50 0.45 0.40 0.35 0.30 0.25 pH7.4磷酸缓冲液（mL） 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 充分摇匀后，置于37℃水浴，保温10min 2，4-二硝基苯肼溶液（mL） 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 充分摇匀后，置于37℃水浴，保温20min 0.4mol/LNaOH（mL） 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 充分摇匀后，室温静置30min后，520nm波长下比色 A520nm值 相当丙酮酸含量（μmol） — 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 相当GPT单位（100mL） —