焦磷酸测序中PCR引物与测序引物的设计.pdfVIP

第4l卷 分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告 第5期 Chinese of 744—748 2013年5月 JoumM AnM”icMChemistry 焦磷酸测序中PCR引物与测序引物的设计 叶卉1 刘云龙1 邹秉杰2 武海萍3 周国华刈’2’3 1(中国药科大学生命科学与技术学院，南京210009) 2(南京大学医学院临床学院(南京军区南京总医院)药理科，南京210002) 3(华东医学生物技术研究所，南京210002) 摘要利用焦磷酸测序技术进行核酸序列测定时，测序信号过低或非特异性信号过高均会导致测序失败。 因此，PCR引物与测序引物的设计十分重要。本研究以rs8175347为例，通过设计具有不同多聚酶亲和指数 (PPI)的PCR引物，并运用焦磷酸测序测定其扩增产物，考察了PPI值对扩增效率以及测序信号的影响；以 rs914232、rs671位点为例，对比不同测序方向以及dNTP的推注顺序，考察了两者对测序结果的影响。结果表 明，提高PCR引物的PPI值有助于增强扩增效率与测序结果的信号峰强度，测序方向和dNTP推注顺序的不 合理选择会严重干扰部分SNP测序结果的判断。因此，在设计PCR引物时，应将多聚酶亲和指数理论与传统 基于解链温度值的引物设计思路相结合，为焦磷酸测序提供高质量的测序模板；在进行定量测序时，还要综合 考虑待测位点(SNP)两侧的序列，选择合适的测序方向以及dNTP的推注顺序，使测序结果更加准确。 关键词焦磷酸测序；PCR引物；测序引物 1 引 言 焦磷酸测序技术…的测序原理是：引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶、三磷酸腺苷硫酸化 酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶等4种酶的协同作用下完成循环测序反应。当加入的dNTP与模 板互补时，1 DNA模板与互补的dNTP聚合时可以产生等摩尔PPi，在三磷酸腺苷硫酸化酶的催化 pmol 下，PPi与5’．磷酸化硫酸腺苷反应生成等量的ATP；荧光素酶催化作用下，ATP与虫荧光素反应生成氧 化虫荧光素并发出等量的可见光，可用光电转换装置检测。产生的荧光信号以峰的形式出现，其强度与 苷酸序列。 焦磷酸测序技术以其准确、快速、简便的技术特点，在单核苷酸多态性分析旧’3j、等位基因频率测 定[4’5]、微生物鉴定分型m7|、甲基化分析旧J、表达量测定归1等方面的应用中展现了巨大的优势。然而， 在利用焦磷酸测序技术进行核酸序列测定时，常因测序信号过低或出现过高的非特异性背景信号而使测 序失败，无法得到正确的核酸序列信息，前者主要由于PCR扩增引物的扩增效率不高，造成扩增产物浓度 低，无法制备得到足够多的单链测序模板；后者则是因为测序引物与模板在非待测区域产生错配延伸或是 测序引物自身形成了二聚体延伸产生了非特异性信号，干扰了测序结果。因此，要获得准确可靠的焦磷 酸测序结果，扩增引物与测序引物的设计十分重要，有必要系统研究焦磷酸测序中引物的设计方法。 2 实验部分 2．1仪器与试剂 GenGenius凝胶电泳成像仪(美国Syngene公司)。 TaqDNA聚合酶，500bpDNALadder rylase)，单链结合蛋白(Single—strandedbinding DNA 2012-09．13收稿；2013旬1—15接受 本文系国家自然科学基金(No资助 +E-mail：shz}lou@nju．edu．cn 万方数据 第5期 叶卉等：焦磷酸测序中PCR引物与测序引物的设计 745 DNA 聚合酶，500 Ladder bp