红球菌P14降解类固醇激素及其相关基因的初步研究.pdf

红球 菌 P14 降 解类 固醇 激 素及其 相关 基因 研究 摘 要 在众多的环境内分泌干扰物中,类固醇激素的干扰活性最强,并且难以降解可以长 期存在环境中,对人类健康造成极大危害因而 受到社会的广泛关注。微生物降解 是去除 类固醇激素污染的一种非常有效方法。 本论文以类固醇激素为研究对象,选择 实验室前 期分离 的一株具有浮起至油层的性质且能降解 多环芳烃 的海洋菌 Rhodococcus sp.P14 为研 究菌株,基于全基因组测序的生物信息学分析结果,主要研究菌株对类固醇激素降解能 力、降解的中间代谢产物检测及降解相关的功能基因 的表达验证,探讨菌株降解类固醇 激素的机制。 本文研究的主要结果如 下: 红球菌 P14 对 100μg/mL 卡那霉素不敏感;对 100μg/mL 羧苄青霉素 、50μg/mL 四环 素、100μg/mL 氨苄青 霉素、170μg/mL 氯霉 素、50μg/mL 链霉素敏 感。菌株能够在 0% 到 5.5% 的 盐浓度范围内都能够生长,说明该菌的耐盐范围很广,适应性强。 菌株 P14 能够在以 50mg/L 的 T 和 AD 为唯一 碳源的 无机盐培养基中生长,不能够在 以 50mg/L 的 E1、E2、E3、EE2、ADD 、P 为 唯一碳源的 无机盐培养基 中生长,说明 P14 能够利用类固醇激素 T 和 AD 为碳源进行生长 。 不添加其它碳源条件下 检测对 50mg/L 的 E1、E2 、E3、EE2 在 7 天内的降解情况。实验表明: 菌株 P14 能够降解 E3 和 T 且降解能 力较高在第七天的降解率分别为 95.7% 和 69.97% ;菌株 P14 能够降解 E2 但是降解能力不 高约 35% ;菌株 P14 在 7 天内都不能降解 E1、EE2。添加其它碳源的情况下测 P14 降解 不同浓度的 10mg/L 、50mg/L 、100mg/L 的 E2 、T 和 EE2 实验表明菌株 P14 能够内几乎完 全降解 10mg/L 、50mg/L 、100mg/L 的 E2 和 T ,不能降解 EE2。 利用 GC-MS 检测菌株 P14 在降解 E2 和 T 过程中的代谢产物 ,检测到 E2 的代谢产物 E1 和 T 的代谢产物雄甾-4 烯-3.17 二酮(Androst-4-ene-3,17-dione ,AD ) 、雄甾-1、4 二 烯-3.17 二酮(Androsta-1,4-diene-3,17-dione ,ADD )和 17 羟基-17 甲基- 雄甾-1、4 二烯-3 酮(17-hydroxy-17-methyl-androsta-1,4-dien-3-one )。根据检测到的代谢产物,结合 P14 降解实验、全基因组信息 和相关文献,推测 P14 降解 E2 可能途径有两种:第一种为 E2 降解为 E1 然后再转化为 E3 进一步降解,第二种为 E2 直接转化为 E3 进一步降解;推测 P14 降解 T 可能途径为 T 降解为 AD ,再进一 步降解为 ADD ,或者 T 甲基化 后,再脱氢 转化为 17-hydroxy-17-methyl-androsta-1,4-dien-3-one ,再进一步降解 ,最后进入转化为二 氧化碳和水 。 I红球 菌 P14 降 解类 固醇 激 素及其 相关 基因 研究 根据红球菌 P14 全基因组测序精细图,对其进行基因功能注释发现:该菌具有类固 醇激素降解相关的基因如 ketosteroid-9α-hydroxylase (KSH)、3-ketosteroid-Δ1- hydrogenaseKSTD 、3α-hydroxysteroid dehydrogenase (3α-HSD)和 3β-hydroxysteroid dehydrogenase (3β-HSD )等。运用全基因测序预测的 基因全序列信息设计引物 进行 PCR 扩增,构建了 4 个重组菌株分别为 E.coli BL21 DE3 -pET-32a+-446Ksh 、E. coli BL21 DE3-pET-32a +-459Ksd 、E. coli BL21 DE3 -pET-32a +-4229Ksh 和 E. coli BL21 DE3 -pET-32a +-2126Hsd ,SDS和 Western Blotting 验证构建重组 菌异源表达成功。 重组菌 E. coli BL21 DE3 -pET-32a +-4229Ksh 和 E. coli BL21 DE3 -pET-32a +- 2126Hsd 在 1mM IPTG 诱导培养 10 小时后降解 50mg/L 的 E2 的降解 率达到 35.34% 和 17.79% ,重组菌