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Western blot 实验注意事项 一． 蛋白样品的制备 1. 组织样品的制备 ： 按组织净重（g ）：裂解液体积（ml）=1:10 的比例加入相应体积的裂解液（加入 PMSF 使其终浓度为 1mM，适当浓度的蛋白酶抑制剂和磷酸化酶抑制剂以免内源性酶 分解蛋白，影响蛋白质的抽提）进行匀浆。 蛋白质的样品制备是western blotting 的第一步，样品制备是关键步骤，要求可 得获得所有蛋白质，应注意以下问题： 1. 在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。 2. 选择合适的表面活性剂和还原剂，破坏所有非共价结合的蛋白质复合物和共价 二硫键，使其形成各自多肽的溶液。 3. 尽量去除核酸，多糖，脂类等分子的干扰，在裂解完毕离心之后小心取中层澄清 溶液，注意不要吸到底层沉淀和上层脂类。 4. 防止蛋白在处理过程中的人为修饰，制备过程必须在低温下进行，以避免细胞破 碎释放出得各种酶类的修饰。（可以加入PMSF 等酶抑制剂） 5. 样本制备完后分装保存，但是注意不要反复冻融 二． 凝胶的制备 均一胶的制备，分子量较小的蛋