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整体试验思路：
具体实验方法：
RNA提取方法：
Unizol 法：
0.1g样品加1ml 提取缓冲液（Unizol），摇晃，放到冰里。
匀浆：匀浆器用之前要先用DEPC水清洗，再用无水乙醇清洗。
分别取匀浆液到新管中，盖好，做好标记。12000g 2~8℃ 离心10min。
取上清液到另一个离心管中，室温静置5min。
按每ml提取液加入200ul氯仿（三氯甲烷）。剧烈震荡15秒，室温静置2-5min.
12000g 2~8℃ 离心15min。
取上清，按每ml提取液加入500ul异丙醇，混匀。-20℃ 静置2h。
12000g 2~8℃ 离心10min。
去掉上清，加入75%酒精 1ml（该酒精要用DEPC水稀释），7000g 离心 7min。
去掉上清，干燥。
加入20ul或30ul DEPC水溶解。
取5ul电泳检测，1ul测定浓度及纯度，其余的-80度冰箱保存或直接反转录。
5×PrimeScript Buffer 2ul
PrimeScript RT Enzyme Mix1 0.5ul
Oligo dT Primer 0.5ul
Random 6 mers 0.5ul
Total RNA 按说明书要求浓度添加
RNase Free dH2O 加水补齐至总体积为10ul
（注：可成倍扩大体系）
反应条件：
37℃ 15min
85℃ 5 sec
PCR
PCR反应体系：
H2O 11.6ul
dNTP mixture 3.2ul
PCR buffer 2ul
cDNA 1ul
正向引物 1ul
反向引物 1ul
Taq 酶 0.2ul
共：20ul
PCR反应条件：
1． 94℃ 4min
2． 94℃ 30sec
3． 52℃ 45sec （该步退火温度可变）
4． 72℃ 1min
5． Go to 2 cycles 29
6． 72℃ 10min
7． 4℃ forever
（四）实时荧光定量PCR：
Takara 公司 SYBR Premix Ex Taq 试剂盒：
内参基因：一般为β-actin。目的基因与内参基因各做3个平行。
引物设计要求：
PCR扩增产物长度：80~150bp最为合适（可延长至300bp）
引物长度：17~25 mers
GC含量：40~60% （45~55%最佳）
Tm值：正反向引物Tm值不能相差太大
OLIGO：63~68℃
Primer 3：60~65℃
引物序列： A、G、C、T整体分布尽量均匀。不要有部分的GC rich 或AT rich（特别是3’端）。尽量避开T/C 或A/G的连续结构。’末端序列：避免GC rich 或AT rich’端碱基最好为G或C。尽量避免3’末端碱基为T 。
互补序列：避开引物内部或两条引物之间有3个碱基以上的互补序列。两条引物间的3’末端避开有2个以上的互补序列。
反应体系：
SYBR Premix Ex Taq (2×) 10ul
PCR正向引物(10uM) 0.4ul
PCR反向引物(10uM) 0.4ul
cDNA模板 2ul
dH2O 7.2ul
共20ul
程序：
1． 95℃ 30s
2． 94℃ 15s
3． 58℃ 20s
4． 72℃ 20s
+ Plate read
5． Go to 2 ， 39 more times
6． Melt curve 60.0 to95.0℃, increment 0.5℃ for 0.05s + plate read
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