桃总RNA提取方法研究.pdfVIP

江苏农业科学 2008年第6期 一 71一 桃总RNA提取方法研究 蔡志翔，马瑞娟，沈志军，张好艳 ，宋宏峰，许建兰 (江苏省农业科学院园艺研究所 ，江苏南京210014) 摘要：以桃叶片为试材，比较SDS一苯酚法、优化 SDS～苯酚法、LiC1沉淀法、凯基Trizol试剂法的提取效果及叶片存放时间对RNA 质量的影响。结果表明，凯基 Trizol试剂法效果较好 ，产量较高，提取周期最短，RT—PCR得到的条带与目的片段大小一致 ；而 LiC1沉 淀法提取的RNA产量较少；SDS一苯酚法产量高，但有较多DNA残留；优化SDS一苯酚法的DNA残留较少。不同存放时间的叶片提取 效果表明，60d以内提取的RNA产量和质量都较高，而超过60d，随着存放时间的延长，RNA产量减少，质量变差，说明低温存放较长 时间对 RNA提取有一定的影响。 关键词：RNA；桃；RT—PCR 中图分类号：$662．101 文献标志码：A 文章编号：1002—1302(2008)06—0071—02 分离和提纯果树组织中的总 RNA并用于合成 eDNA进 (pH值5．3)，混匀，一20℃放置 3h，4℃、12000r／min离心 行PCR扩增，是从分子水平上检测果树病毒的重要试验手段 1min。弃上清，用70％无水乙醇洗沉淀2次。室温干燥，加 之一。绝大多数果树病毒属 RNA病毒，应用 PCR技术检测 适量DEPC(焦炭酸二乙酯)水 ，一70℃保存备用…。 这类果树病毒时，果树组织中总RNA提取的数量和质量是影 1．2．1．2 优化 SDS一苯酚法 将 SDS一苯酚法的缓冲液提 响PCR检测的关键因素。由于 RNA不稳定、易降解，提取的 取与 s饱和酚、氯仿、异戊醇去除杂质合并成一步，不加 质量不好，在反转录时往往无法合成eDNA或合成的eDNA RNAsin，其余步骤相同。 链长短不一，给研究带来不便，因此提取纯度高、完整性好的 1．2．1．3 LiC1沉淀法 将SDS一苯酚法沉淀步骤改为在上 RNA尤为重要。虽然 目前植物 RNA 的提取方法有 多 清液中加入 1／3体积的LiC1(8mol／L)，使 LiC1终浓度为2 种 J，但由于不同植物组织成分的差异，其最适用的提取方 mol／L，4℃放置，设置不同时间处理，确定最短的合适的RNA 法也不尽相同。本试验以桃叶片为试材 ，选取 目前国内外常 沉淀时间。沉淀完全后，4℃、12000r／rain离心 10min，弃上 用的4种有效的RNA提取方法，研究木本果树高质量 RNA 清，用70％乙醇漂洗沉淀，稍晾干沉淀后加入 500 l的TE缓 的提取方法，为以后开展桃病毒检测等工作奠定基础。 冲液溶解沉淀，加入等体积的氯仿 ：异戊醇(24：1)再抽提 1 次，转移上清至新离心管中，加入2倍体积无水乙醇，一20℃ 1 材料与方法 放置2h以上，4℃、12000r／min离心10min，弃上清，70％乙 1．1 材料 醇清洗沉淀，于超净工作台晾干，加适量 DEPC水完全溶解， 桃叶片取 自国家果树种质南京桃资源圃，品种为霞晖6 一 20℃保存备用 。 号。采集叶片在一70℃条件下保存 ，分别于0d、60d、80d、 1．2．1．4 凯基 Trizol试剂法 参照试剂盒说明的方法 120d、360d后提取RNA。 提取 。 1．2 方法 1．2．2 RNA纯度和完整性检测 取提取的RNA1Ixl，用 1．2．1 高质量RNA提取方法 DEPC水稀释至 100 l，用Eppendoff生物分光光度