SA11株轮状病毒VP3基因的克隆表达及致病机制的初步研究.pdfVIP

- 466 · 免疫学杂志 2011年 6月 第 27卷 第 6期 IMMUNOLOGICALJOURNALVo1．27 No．6 Jun．2011 · 论 著 · 文【章编~-]1000-8861(2011}06--0466-05 SAll株轮状病毒VP3基因的克隆表达及致病机制的初步研究 李 明，何海洋，徐广振，尹 怡，薛 毅，吴玉章，李晋涛 摘【 要】目的 克隆、真核表达SA11株轮状病毒VP3基因，对其致病机制进行了初步研究。方法 用RT—PCR从SA11株 总RNA中扩增出VP3基因，并克隆到真核表达载体pEGFP—C1上 ，构建重组表达载体pEGFP—C1／VP3，用荧光显微镜及West— ernblot检测VP3基因在真核细胞(293T细胞)的表达情况。以重组质粒 pEGFP—C1／Rb94为对照，用流式、荧光显微镜、Western blot观察VP3蛋白对GFP基因表达的抑制作用。结果 在293T细胞中检测到VP3基因的表达；pEGFP—C1／VP3组的流式荧光 强度、Westemblot的蛋白条带大小均明显弱于DEGFP—C1R／b94对照组。结论 成功构建了pEGFP—C1V／P3真核穿梭表达载 体，在真核细胞中有效表达，实验结果提示VP3蛋白可能对宿主细胞大分子蛋白的表达有抑制作用 ，可能是轮状病毒的一种新 的致病机制。 关【键词】轮状病毒；VP3基因；真核表达；致病机制 『申图分类号】R373．2；Q786 f文献标识码】A Cloningandexpressionandpreliminarystudyofthepathogenicmechanism of SAIlrotavirusVP3gene LIMing，HEHaiyang，XUGuangzhen，YINYi，XUEYi，WUYuzhang，LIJintao StudentBrigade，ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing40003China A【bstract】ToexploretherelationshipbetweenSA11VP3andthehostcell，aswellasstudyitspotential molecularmechanism．theCO—expression vectorofVP3ofSA11with EGFPwasconstructed．RT—PCR waspre— formedtoamplifyVP3generfagmentsrfom thereversetranscriptionproductofRV genomeRNA．TheVP3gene fragmentswereharvested and inserted intopEGFP-C1toconstructthepEGFP—C1／VP3 expressionvector．And theexpressionin293T cellwasobservedunderafluorescencemicroscopeandanalyzedbyWesternblotting．Asa controlwithpEGFP—C1／Rb94plasmid，theinhibitionofVP3proteintoGFPgenewasdetectedbyFlow cytometry， fluorescencemicroscopeandWestern blotting．WesternblottingdemonstratedthatpEGFP-C1／VP3couldexpress theVP3proteinin293Tcel1．FluorescenceintensityofpEGFP-C1／VP3groupwassignificantweakerthanthatof pEGFP—C1／Rb94 group．In conclusion，arecombinanteukaryoticCO-expression vectorofpEGFP-C1／VP3was successfullyconsturcted，whichiseffectivelyexpressedineukaryoticcells．VP3proteinmayinhibittheexpression ofhostcellgene．Alltheresultsprovideapossiblepathogenicmechanism ofrotavirusVP3．