核酸的紫外及含量测定.pptVIP

核酸的紫外扫描及含量测定 实验目的 1.了解紫外分光光度计的基本原理并掌握其使用方法。 2.掌握使用紫外分光光度法测定核酸含量的原理和方法。 实验原理 ??? 核酸、核苷酸及其衍生物都具有共轭双键，具有紫外吸收。RNA和DNA的紫外吸收峰为260nm。一般在260 nm波长下，每毫升含1mg DNA溶液的光吸收值约为0.020，每毫升含1mgRNA溶液的光吸收值为0.022。故测定待测浓度RNA或DNA溶液260nm的光吸收值即可计算出其中核酸的含量。此法操作简便，迅速。若样品内混杂有大量的核苷酸或蛋白质等能吸收紫外光的物质，则测定误差较大，故应设法事先除去。纯净的RNA溶液，其A260/A280≥2；纯净的DNA溶液，其A260/A280≥1.8。 ?? 实验原理 如果已知待测的核酸样品不含酸溶性核苷酸或可透析的低聚多核苷酸，即可将样品配制成一定浓度的溶液(20～50mg/mL)，在紫外分光光度计上直接测定。 ??? 蛋白质由于含有芳香氨基酸，因此也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在280nm处，在260nm处的吸收值仅为核酸的十分之一或更低，故核酸样品中蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。 ??? RNA在260nm与280nm处的吸收比值在2.0以上，DNA的比值则在1.9左右。当样品中蛋白质含量较高时，比值即下降。 实验器材 操作指南：插上电源插头，打开仪器右侧面下方的电源开关，将仪器背面下方的灯光选择杆拨到“D”处（即氘灯），再按一下仪器左侧面下方的氘灯触发按钮，氘灯即点亮。调节“波长调节旋钮”使波长显示窗中的数字为所需的波长（如260nm），推开比色室的盖子。将空白和样品溶液分别仔细倒入特殊的石英比色皿中（倒入之前先用少量蒸馏水，再用少量待测溶液各润洗比色皿一次），用卫生纸擦去比色皿表面的余液，然后将比色皿插入比色室里的卡座中，拉动卡座拉杆，将空白液的比色皿置于光路中。按一下“MODE”键，使“%T”的指示灯亮，在比色室的盖子打开的状态下按一下“0%T”键，使显示窗中的数字为0.0。关闭比色室的盖子，按一下“100%T ABSO”键，使显示窗中的数字为100.0。这样，仪器就调整好了。注意，每测一次样品前都要重新调整“0％”和 “100％”。再按一下“MODE”键，使“ABS”指示灯亮，按一下“100%T ABSO”键，使显示窗中的数字为 0.000。 拉动卡座拉杆，将样品液的比色皿置于光路中，此时，显示窗中的数字即为样品的吸光度。按一下“PRINT”键，将测定结果打印出来。注意，每次测定下一个样之前都需要用空白重新调校“0％T”和 “100％T”。测定完后，将比色皿中的溶液倒入原试管中（以备测错了重测），先用自来水内外冲洗干净比色皿，再用洗瓶冲洗比色皿的内外表面1次，将其粗糙面朝下斜靠在培养皿中。注意保持分光光度计的比色室内始终干燥干净，严禁将溶液洒落比色室。不测定时，请将比色室的盖子打开。另外，最近出了一种改进型的UV-9100型紫外可见分光光度计，在调整“0%T”时需要关闭比色室的盖子，将比色皿卡座最前端的挡板置于光路中，按“0%T”键可将“T”调为0％。 关于比色皿：比色皿的前后有2个光滑面，是用来对准光路的，左右有2个粗糙面，手只能拿比色皿的粗糙面，不能接触光滑面。比色皿的内部的清洗只能用蒸馏水润洗（用洗瓶），不可用卫生纸或其他物品捅进去擦洗，比色皿的2个光滑面一定要保持清洁，如发现有指纹或残液，须用卫生纸轻轻擦拭干净。比色皿是成套发放的，严禁混用，本实验使用的是石英比色皿，一套2只。使用完毕后先用自来水内外冲洗干净比色皿，再用洗瓶冲洗比色皿的内外表面1次，将其粗糙面朝下斜靠在培养皿中，参见图7-2。 2.取样器：参见实验一，5mL、1mL各1只/组。 使用指南：接好套头（不漏气）→通过旋钮调节容量（如500表示5mL）→用活塞第一挡吸液→用活塞第一挡和第二挡放液→换套头→继续使用。注意，平时取样器应挂在架子上，绝不可倒置，以免溶液倒流入枪体中而损坏仪器。 3.其他器材：试管，试管架、烧杯、卫生纸。 实验试剂 1.??????? 标准DNA溶液：100ug/ml 2.??????? 待测的DNA溶液 实验操作 检查试管是否干燥、洁净；若否，将其洗净并置于干燥箱内120℃烘干。 1．??? 标准曲线的制作：取7只试管、2只取样器（分别为1mL和5mL），按照下表加样。 标准曲线的制作 混匀后以1号试管为空白在260nm处测定光吸收值A，以标准DNA溶液的毫升数为横坐标、A为纵坐标在坐标纸上绘制出标准曲线，它是一条直线。 2．? 核酸最大紫外吸收波长（λｍ）的确定：以表7-1中的７号试管为测定对象，以1号试管为空白，在240～290nm范围内每隔10nm分别测定光吸收值