噬菌体随机肽库对肝癌细胞特异性结合短肽的筛选及鉴定.docVIP

噬菌体随机肽库对肝癌细胞特异性结合短肽的筛选及鉴定 作者：张旭 彭健 王顺伟 杨璞 于丽 胡玉 张阳德 【摘要】 目的： 通过噬菌体随机肽库，筛选人肝癌细胞结合短肽，并对其与肝癌细胞的特异结合能力进行生物学鉴定. 方法： 以L02为阴性消减细胞， HepG2为靶细胞，对噬菌体随机七肽库进行4轮消减筛选. 并随机挑取26个阳性噬菌体克隆进行序列测定及同源性分析. 以ELISA法鉴定噬菌体与HepG2细胞的结合活性. 通过免疫细胞化学染色、免疫组织化学染色鉴定H3噬菌体克隆与肝癌细胞结合的特异性. 人工合成短肽HBP3，利用免疫荧光技术观察其与肝癌细胞的结合特异性. 结果： 4轮筛选使噬菌体在靶细胞HepG2上出现明显富集. 所挑取的26个阳性噬菌斑，经测序得到各噬菌体单克隆的多肽插入序列，最终产生5条氨基酸序列. 经BLAST分析发现，在蛋白质数据库中未发现与这些短肽序列具有较好同源性的蛋白质分子. ELISA分析鉴定显示，5个阳性克隆在HepG2和L02细胞上有差异性结合，其中H3噬菌体克隆对两种细胞的结合差异性最大. 免疫细胞化学染色及免疫组织化学染色均显示，H3噬菌体克隆对肝癌细胞的结合靶向性明显高于对照细胞. 免疫荧光显色证实，FITCHBP3能特异性地结合于肝癌细胞的胞膜及核周胞质. 结论： H3噬菌体克隆所呈现的七肽HBP3能与靶细胞高亲合性结合，为进一步研制用于治疗肝癌的高靶向性药物奠定实验基础. 【关键词】 肝肿瘤；肿瘤细胞；噬菌体肽库；消减筛选；短肽 0引言 肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是人类最常见的恶性肿瘤之一，发病率呈逐年上升趋势. 其治疗主要以手术、化疗和放疗为主，但疗效都不是很理想［1-2］. 因而迫切需要有创新性、突破性的早期治疗手段，而肿瘤基因疗法为此提供了一条新思路. 目前，无论是离体基因治疗，还是体内基因治疗，实际的治疗效果仍然不能令人满意. 如何进一步提高基因治疗的靶向性，从而实现基因的高效表达是其重要的技术障碍. 为此，使用不同筛选方法获得肝癌细胞特异性结合分子，已成为提高肝癌基因治疗效果的重要途径之一. 近年来，噬菌体表面呈现技术已被不断地发展和完善，并被广泛用于筛选多肽及蛋白质. 它将外源蛋白的基因型与表型联系在一起，把与其他分子的结合活性和噬菌体的可扩增性统一起来，科学家们已成功构建了多种类型的噬菌体随机肽库［3-4］. 利用噬菌体肽库进行筛选，不需预先知道受体分子的结构信息，能够得到一些与低浓度靶分子特异结合的短肽，是一种高效的筛选体系［5］. 因此，我们以人正常肝细胞（L02）为消减细胞，利用噬菌体展示技术，通过对体外培养人肝癌细胞（HepG2）的筛选，旨在得到一批能与人肝癌细胞特异性结合的七肽，为肝癌的靶向治疗提供新的候选分子. 1材料和方法 1.1材料人肝癌细胞株HepG2及人正常肝细胞株L02：国内建系，本实验室细胞库冻存. HBP3人工合成肽H3噬菌体呈现短肽，及无关噬菌体（URPs）插入片段的人工合成短肽URBP均由上海生工公司依照HBP1的氨基酸序列合成的，并于末端标记FITC，纯度为98%，于-20℃保存. 噬菌体随机七肽库（Ph.D.-7TM Phage display peptide library）购自New England Biolabs公司. 大肠杆菌E.coli ER2738购自New England Biolabs公司. M13噬菌体单链DNA提取试剂盒购自上海华舜生物公司. ELISA TMB 显色试剂盒购自万泰生物药业. 鼠抗M13 mAb, HRP标记的鼠抗M13 mAb购自Pharmacia Biotech公司. 1.2方法 1.2.1噬菌体随机七肽库的体外消减筛选以L02细胞为阴性消减细胞，HepG2细胞为靶细胞，参照噬菌体随机肽库的使用说明书［6］、优化改良筛选方法，进行4轮消减筛选，并逐渐增加筛选压力. 所得噬菌体经扩增、滴定，取2×1011pfu投入下一轮筛选. 每轮噬菌体投入量均为2×1011pfu，共进行4轮筛选. 并逐渐增加筛选强度：与阴性细胞孵育的时间先后增加至1.25，1.5，2 h，与靶细胞的孵育时间先后减为45，30，15 min；TBST混旋洗涤次数也相应地增至4，6，8次. 1.2.2阳性噬菌体克隆的挑选经4轮体外筛选所得的噬菌体滴定后铺制LB平板，并挑取噬菌体单克隆，以备测序、鉴定. 将经筛选所得的噬菌体液感染宿主菌E.coli ER2738，铺制LB/IPTG/Xgal平板，37℃，过夜培养；在长出蓝色噬菌