实验二十二动物寄生虫病的Dot-ELISA法诊断技术.docVIP

实验二十二 动物寄生虫病Dot-ELISA法诊断技术 斑点ELISA（Dot-ELISA）是在常规ELISA方法的基础上发展起来的，1982年Hawks等及Herbrind等以硝酸纤维素膜(NC膜)为固相载体几乎同时建立了Dot-ELISA检测法，保留了常规ELISA特异、敏感、经济、快速、可自动化等优点，而且NC膜具有更好的吸附能力(可100%吸附)，用离子型去污剂裂解的抗原也能很好地吸附，从而使该方法迅速得到推广，被认为是传染病及寄生虫病诊断技术标准化最有前途的新技术之一。以硝酸纤维膜（NC膜）代替聚苯乙烯板，在膜上滴加抗原或抗体，封闭后，按常规ELISA实验操作，最后用不溶性底物显色，一般是二氨基邻笨胺（DAB），其氧化产物为不溶的棕色产物，根据显色反应有无或颜色深浅，进行定性或半定量。斑点ELISA方法具有以下优点：特异性强，假阳性少；由于NC膜对蛋白质的吸附能力优于聚苯乙烯，故其敏感性比常规ELISA高6-8倍；试剂用量少，比常规ELISA至少节约10倍；抗原膜保存期长，-20℃可保存半年；检测结果可长期保存；操作简便，不需特殊仪器（酶联检测仪）。此法简易快速，便于推广，目前已广泛用于多种寄生虫病的诊断和监测，如弓形虫病、包虫病、囊虫病、捻转血矛线虫病、血吸虫病、华枝睾吸虫病、旋毛虫病等抗原或抗体的检测。 一、实验目的及要求 了解Dot-ELISA的原理和基本操作过程。 二、实验器材 1．器材。 硝酸纤维膜（NC膜）或聚氯乙烯（PVC）白色薄膜凹孔板、微量加样器、滤纸、玻璃皿等。 2．0.01mol/L PBS (pH7.4)。 KH2PO4 0.2g Na2HPO4?12H2O 2.9g NaCl 8.0g KCl 0.2g 蒸馏水加至 1000ml 3．Tris缓冲液的配制。 0.05M TBS(pH7.4)的配制： Tris（三羟甲基胺基甲烷） 12.1g NaCl 17.5g 蒸馏水加至 1500ml 磁性搅拌下滴加浓HCl至pH为7.4，再加蒸馏水至2000ml。 4．封闭液。为2%BSA的0.01mol/L pH 7.4的PBS等。 5．PBST洗涤液。 为0.5%Tween-20 0.01mol/L pH 7.4的PBS。 6．底物溶液。 二氨基联苯胺（DAB）：0.05% DAB + 0.3% H2O2；4-氯-1萘酚：用甲醇配制0.3%母液，4℃保存，用前取1 ml母液加0.05 mol/L TBS 5ml，再加30% H2O210ul。 7．酶标抗体。 辣根过氧化物酶标记抗体、酶标二抗或辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白（SPA）。 三、实验方法、步骤和操作要领 （一）直接法测抗原（以检测血吸虫循环抗原为例） 1．原理。 将待检血清点在NC膜上，如血清中含日本血吸虫循环抗原则包被在NC膜上形成固相抗原，加入酶抗记的抗血吸虫单克隆抗体，与固相抗原形成抗原-酶标抗体复合物，再加入底物，复合物上的酶则催化底物而显色，由于每步之间均有冲洗步骤，因此，若样品中不含有血吸虫循环抗原，酶标抗体则将被洗掉，底物不显色而呈阴性反应。 2．操作方法。 具体操作如下： 取适当大小NC膜，用铅笔画或使用点膜器制备直径5mm的加样孔，并作好相应标记。 将NC膜浸入到0.01mol/L pH 7.4的PBS中15～30 min，取出用滤纸吸干。 将对照阳性血清、阴性血清和待检血清分别点加于加样孔内，室温干燥。 将NC膜浸入封闭液中振摇封闭30min。 将NC膜浸入洗涤液中振荡洗涤3次，每次5min，取出用滤纸吸干。 将NC膜浸入单克隆酶标抗体溶液中，振摇反应30min。 重复步骤5。 将NC膜浸入底物溶液中，振摇显色10～20min。 用流水冲洗数分钟，放入蒸馏水中终止反应。 3.判定标准。 根据显色反应有无或颜色深浅，进行定性或半定量：斑点呈深褐红色为+++，褐红色为++，浅褐红色为+，无色为阴性。 （二）间接法测抗体（以检测旋毛虫病抗体为例） 1．原理。 将特异性抗原点在NC膜上，干燥形成固相抗原，加入待检血清，如血清中含有抗旋毛虫特异抗体，则与固相抗原形成抗原-抗体复合物，再加入酶标记的抗抗体（或酶标SPA），与上述抗原-抗体复合物结合。此时加入底物，复合物上的酶则催化底物而显色（反应过程见图22-1）。由于每步之间均有冲洗步骤。因此，若待检血清中不含相应的抗体，酶标抗体将被洗掉，底物不显色而呈阴性反应。 固相Ag Ab Ag-Ab结合物 酶标抗Ab Ag-Ab-抗Ab-酶复合物 2．操作方法。 具体操作如下： (1) 抗原的制备。 收集纯净的浓集旋毛虫幼虫，经研磨至显微镜下观察不到虫体碎片，反复冷浸，离心沉淀，弃去沉渣。再经水浴离心后，呈乳白色的