Toll样受体4 siRNA 表达载体的构建及其在体外对RAW264.7细胞TLR4的抑制效果.DOCVIP

临床医学论文-Toll样受体4 siRNA 表达载体的构建及其在体外对RAW264.7细胞TLR4的抑制效果 ???????? 作者：徐哲，黄长形，李羽，王平忠，任广立，张岩，刘清泉，贾战生，聂青和，孙永涛，白雪帆 【摘要】? 　　目的： 构建针对小鼠Toll样受体4(TLR4)的小干扰RNA(siRNA)表达载体，体外评价对RAW264.7细胞TLR4 mRNA及蛋白水平的抑制效果；观察对TNFα， MIP2水平及p38MAPK， ERK1/2磷酸化水平的影响. 方法： 根据siRNA设计原则并经BLAST比对，设计合成7条siRNA双链复合体，体外退火后在T4连接酶作用下连接入重组载体pSilencerTM 4.1CMV neo plasmid，连接产物转化JM l09感受态细胞，筛选阳性克隆并提取重组体，行HindⅢ及BamHⅠ双酶切，酶切产物经聚丙稀酰胺凝胶电泳确定插入片段，测序鉴定；RTPCR检测TLR4 mRNA水平变化，间接免疫荧光及Western Blot检测TLR4蛋白水平变化；用LPS刺激转染细胞，观察TNFα及MIP2水平的变化，Western Blot检测p38MAPK及ERK1/2磷酸化水平的变化. 结果： 双酶切及测序证实重组载体构建成功；体外实验表明，RAW264.7细胞中TLR4 mRNA及蛋白水平均降低；TLR4 siRNA抑制L