K-ras突变多肽负载树突状细胞诱导胰腺癌免疫治疗研究.pdf

K·r弘突变多肽负载树突状细胞诱导胰腺癌的免疫治疗研究 中文摘要 K—r as突变多肽负载树突状细胞诱导胰腺癌的 免疫治疗研究 中 文 摘 要 胰腺癌由于特殊的解剖及生物学特点，其诊治现状还很不理想。探 索新的治疗手段，成为目前胰腺癌研究的重中之重。树突状细胞(DC)是 体内功能最强的专职性抗原递里细胞，能摄取、加工和递呈抗原，刺激 未致敏的T淋巴细胞增殖活化，是启动、调控并维持特异性免疫应答的 中心环节。制备肿瘤特异性DC疫苗免疫肿瘤患者，诱导针对肿瘤的特 异性免疫应答已成为近年来肿瘤免疫治疗的研究热点。 K．豫s基因突变在胰腺癌有特异性表达，且突变类型及位点较为固 定。本研究通过分子生物学方法检测K．ras基因的突变类型及位点，利 用合成突变多肽表达突变抗原位点，体外负载DC，制各具有生物学活性 的DC疫苗。同时评估其诱导出针对胰腺癌特异性免疫应答的效率。为 今后的临床应用提供理论及实验依据。 第一部分 K-ras突变基因的检测及其意义 目的 克隆K．ras基因，通过测序明确突变位点和类型。 方法 K．ras基因点突变在胰腺癌有特异性表达，使用逆转录·聚合酶链 K．ras原癌基因序列比对，检测突变位点和类型。 结果 琼脂糖电泳显示RT．PCR扩增产物片段为580bp，产物特异性高，未 见非特异性条带，提纯后测序显示目的片段即为k-ras基因 K-ras突变多肽负载树突状细胞诱导胰腺癌的免痤治疗研究 中文摘要 GGT--*GTT，第l 第12位氨基酸由甘氨酸(Gly)突变为缬氨酸(Val)。 突变位点和类型，为胰腺癌免疫治疗研究创造了条件。 【关键词】 - 胰腺癌；K．ras癌基因；RT-PCR；序列测定 K-rasl 第二部分 2位突变(Val)特异性DC疫苗的制备 及生物学活性的鉴定 异性抗肿瘤免疫应答的能力。 方法：合成含突变位点的多肽，负载外周血单核细胞来源的未成熟DC， 表面的表达率。体外采用3H．TdR掺入试验和MTT法测定DC体 外刺激T游巴细胞活化增殖和K．ras特异性CTL细胞杀伤肿瘤细 胞的能力，观察K．ras特异性CTL对正常细胞的杀伤作用。 结果：合成突变多肽能被未成熟DC摄取，有效地在成熟DC表面表达突 淋巴细胞活化增殖。与非特异性对照组相比，激发的K．ras特异往 CTL能有效地杀伤表达相应突变肿瘤细胞，对正常细胞无明显的杀 伤作用。 结论：成功制备出具有生物学活性的K．rasl2位突变(Val)特异性DC疫苗， 该疫苗能有效地诱导T淋巴细胞产生肿瘤特异性免疫应答。 【关键词】胰腺癌 K．ras突变多肽DC疫苗 免疫治疗 Ⅱ K-ras突变多肽负载树寒状细胞诱导胰腺癌的免疫治疗研究 中文摘要 第三部分 K-ras特异性CTL对胰腺癌荷瘤裸鼠 的治疗和保护作用 目的：观察K．ras特异性CTL对裸鼠胰腺癌移植瘤生长抑制作用及对裸 鼠的免疫保护作用，比较不同途径进行被动免疫治疗的效果。 方法：组织块皮下种植建立裸鼠胰腺癌模型，免疫组化法检测其K—ras 突变类型。分别予K．1aS特异性CTL肿瘤瘤内及尾静脉注射，同时 设立非特异性免疫治疗组和空白对照组，记录移植瘤的生长情况， 分析不同治疗手段对肿瘤抑制的效果及对荷瘤裸鼠的保护作用。 特异性CTL瘤内治疗组瘤体生长速度明显低于空白对照组及非特 迁移到肿瘤灶发挥免疫杀伤作用，K-ra