DNA的提取纯化.pptVIP

核酸的提取和纯化 孙长城 2010-6-4 目的和要求 掌握核酸制备的原理和方法 掌握核酸的分类、化学组成及存在形式 掌握核酸提取纯化过程中的注意事项 核酸的分类 核酸按其化学组成可以分为两大类： 含有核糖的核糖核酸（RNA），主要存在于细胞质及核仁内。 含脱氧核糖的脱氧核糖核酸（DNA），主要存在于细胞核中。 在细胞内核酸通常以核蛋白的形式存在。 真核细胞的染色体在细胞周期的大部分时间以染色质的形式存在，染色质是一种纤维状结构又叫做染色质丝，它是由最基本的单位核小体成串排列而成的，核小体有组蛋白和DNA共同组成。 RNA在细胞核内合成，主要分布在胞浆中，它的主要作用是在的遗传信息表达为蛋白质的氨基酸序列时发挥作用，按照所起作用的不同和结构的特点分为：信使RNA、转运RNA、核糖体RNA。 信使RNA mRNA 占细胞内RNA总量的3%可从DNA 获得遗传信息，并作为指导蛋白质合成的模板。 转运RNA（tRNA）,占细胞内RNA总量的15%左右，可携带氨基酸，将其转运到核糖体上，供蛋白质合成使用。 核糖体RNA（rRNA） 是细胞内含量最多的RNA,它和蛋白质共同构成核糖体是蛋白质合成的机器。 实验原理 在生物体内，核酸多是以核蛋白的形式存在于组织中的，根据核糖核蛋白和脱氧核糖核蛋白在不同浓度电解质溶液中的溶解度有明显差别的性质而进行分离。 0.14M NaCl 核糖核蛋白 脱氧核糖核蛋白 仅为水中溶解度的1% 1.0 M NaCl 脱氧核糖核蛋白的溶解多比水中大两倍。 此外两种核蛋白的溶解度与pH值有关，脱氧核糖核蛋白在pH 4.2时溶解度最低，而核糖核蛋白在pH 2.0-2.5时最低。 氯仿-异戊醇抽提核酸：加入蛋白质变性沉淀剂如氯仿-异戊醇、十二烷基磺酸钠、苯酚等有助于除去蛋白质。 经离心溶液可以分为上中下三层：氯仿比重大在下层，中层为变性的蛋白质凝胶，上层为核酸溶液。 乙醇沉淀纯化核酸：然后再利用核酸不溶于乙醇等有机溶剂的性质，而从溶液中沉淀析出。 实验注意事项 提取和纯化核酸的一个根本要求就是保持核酸的完整性。 1、细胞内存在很高的核酸酶活力会把核酸降解。 2、化学因素降解，如过酸或过碱及其他化学因素。 3、物理因素降解，如温度过高或机械力剪切。 因此在操作中要防止过酸或过碱，在一定合适的PH环境中进行，全程温度应在低温下0-40C进行，必要时要加入抑制剂，抑制核酸酶的作用。 EDTA和柠檬酸盐等可抑制DNA酶的活性。 十二烷基磺酸钠（ SDS ）和苯酚，不但可以作为蛋白质变性剂来分离核酸，也可以使DNA酶、RNA酶失活。 结果与讨论 1、根据实验原理详细说明DNA提取时每次离心后沉淀和上清的保留或弃去的原因。 2、根据核酸的性质说明在提取和纯化核酸操作中应该注意的事项。 预习实验十七：DNA 琼脂糖凝胶电泳 * * 5 ml fresh liver homogenate （0.14M NaCl-0.15M EDTA匀浆液） 3500rpm,10min 沉淀 上清 加两倍体积 1M NaCl-0.15M 柠檬酸钠, 室温 ，15 min , 3500rpm，10min Pellet discard 上清 加 2 倍体积 95% 乙醇 3500rpm，10min 沉淀 上清（弃去） + 1ml TBE 鉴定 保存 –200C 加 等体积的氯仿-异戊醇（24：1，V/V） 振摇，10 min, 3500rpm，10min 上清（水相） 沉淀 弃去 加 等体积的氯仿-异戊醇 振摇，10 min, 3500rpm，10min Pellet discard 上清 加 2 倍体积 95% 乙醇 3500rpm，10min 沉淀 supernatant + 2ml 0.14M NaCl-0.15M EDTA 鉴定 RNA-nucleprotein DNA-nucleoprotein