pcDNA30SV40T重组质粒构建及其在鹅小肠上皮细胞中表达.pdfVIP

pcDNA3．0．SV40T重组质粒的构建 及其在鹅小肠上皮细胞中的表达 研究生：李融 导师：赵国琦教授 (扬州大学动物科技学院，225009) 摘要 本研究旨在利用SV40T抗原基因能促进细胞永生化的功能，采用真核表达质 化的鹅小肠上皮细胞，使其与细胞DNA整合发生同源重组。最后通过从转染细胞 因进行细胞永生化研究提供了稳定、可靠的分子工具。 本试验旨在探索鹅小肠上皮细胞体外培养的条件及简便可行的分离纯化方 法，得到纯度较高的鹅小肠上皮细胞。本试验取29．30日龄的鹅胚为试验材料，通 过组织块种植法和酶消化法进行原代鹅小肠上皮的体外培养，采用刮除法、相差 通过形态学观察及免疫细胞化学法进行鉴定。采用MTT显色法定量研究了不同温 对鹅原代小肠上皮细胞生长的影响。结果表明：通过组织块种植法得到的鹅小肠 上皮细胞生长状况良好，细胞活性较强，经过纯化，得到了纯度较高的鹅小肠上 型)、多次(短时间)消化收获细胞法虽然可获得大量的健全肠绒毛隐窝单位，但 传代后其增殖能力明显下降。形态学观察及免疫细胞化学法鉴定为阳性，证明分 离来的细胞为小肠上皮细胞，从而为鹅小肠上皮细胞的永生化研究提供较好了细 胞材料。鹅小肠上皮细胞在39℃条件下的增殖能力略优于其在37℃时的；在 5％～7．5％C02下的增殖速度相对较快；FBS用量则应以5‰7．5％为宜。 建成功。 本试验采用脂顾体转染技术，将含有SV40T基因的重组表达质粒 和 pcDNA3：0：SV40T导入经纯化的鹅小肠上皮细胞稠过基因组DN 检测SV40T基因在鹅小肠上皮细胞中的表达情况。根据设计的不．A同P引C物RRT扩-P增CR序-一ysJ ， 基因组DNA 特异性条带，表明SV40T基因在鹅小肠上皮细胞中成功表达。从而，重组质粒 pcDNA3．0：：SV40T为进一步构建永生化细胞系奠定了理论基础。 关键词 鹅胚；小肠上皮细胞；体外培养；重组质粒；SV40T；永生化 ConstructionofRecombinantPlasmid and inGoose pcDNA3．0．SV40TExpression Cells Epithelial Li M．S．Candidate：Rong Zhao Advisor：Prof．Guoqi ofAnimalScienceand College Technology,YangzhouUniversity,225009 Abstract This was ofSV40 T tousethefunction which studydesigned largeantigengene can cellsimmortalizedandconstructeda recombinant promote plasmid Molecular SV40T