人胰岛素原基因在体外培养的NIH 3T3细胞中的基因转移和表达研究.pdfVIP

人麟岛素原基因在体外培养的NIH3T3 细胞中的基因转移和表达研究 硕士研究生:白 然 指 导 教师:李昌臣教 授 指 导 小组:李 跃 别教授 马郁芳 剐教授 专 业 名称:内科学 摘 要 1型箱尿病是一种由胶岛p细胞免疫性破坏所致胶岛索绝对映乏 的代谢性疾病。对其治疗最常用的方法是外抓性旅岛t注射治疗，但 这种疗法由于注射后吸收较住，缺乏t物反谈调节作用，井不特合生 理反应要求，而且要长期反复注射，严密监侧血箱等，给息者带来了 不少麻烦和痛苦。而随后发展的演岛移植技术，又因供体来撼不足， 免疫排斥且其远期疗效并不满意，使其难以推广。若在息者的腆旅外 组织建立呈生理模式调控的腆岛素分泌必将是泊疗I型箱尿病的最理 想疗法.yA，岛，。因，某些血。。节.，因的，。和以逆转录病。 载体，脂质体为荃础的基因转移技术的建立以及实脸性抢尿润动物模 型的日趋成熟，为籍尿病的基因治疗提供了前提。为了研究人肤岛紊 原墓因在体外培养的小鼠成纤维细胞 NIH3T3细施系的荃因转移和 表达情况，建立体细胞胰岛索荃因转移的治疗程序，进而为1型抢尿 病的荃因治疗提供实脸依据。本研究采用了脂质体转染法分别将未携 带外源基因的逆转录病毒载体pLNCX和携带大鼠礴酸烯醉式丙酮酸狡 ~ 1~ 潇醉 (PEPCK)启动子一人胶岛索原基因 (INS)的重组逆转录病毒载 体pN-PEPCK-INS转染到体外培养的NIH3T3细胞系中。转染后72小 时，用G418筛选出阳性细胞克隆并培养至24天，提取细胞的染色体 DNA，行PCR扩增，电泳检查转入荃因情况。同时，用放射免疫分析 方法 (RIA)监侧培养液的胶岛s水平及转染后24天的细胞内胰岛素 水平。结果 PCR证实 pLNCX 和 pN-PEPCK-INS均整合到 NIH3T3 细胞的染色体中。培养液的胶岛t水平于转染前后均无明显变化 (P0.05)，而转入pN-PEPCK-INS的肛H3T3细胞内的浪岛索水平则 于转染后24天明显高于未转染组(P0.01)及pLNCX转染组(P0.05). 分析其可能的原因为:(1)细旅外无高血特等刺橄作用，细胞内表达 的胶岛紊尚不能分泌到细血外。(2)NIH3T3细胞可能缺乏分泌族岛 素所孺的特异性荀萄箱转运蛋白(GLUT,)和芍萄箱徽醉 (PK)，从 而不能出现胶岛素释放反应。这一结果表明人族岛索原荃因在NIH3T3 细胞系转移成功并在细业内获得高效衰达，尽管农达的族岛t未能分 泌出细胞外且未进行有关胶出v羞因表达调控方面的实脸，但本研究 为抢尿病荃因治疗这一新思路进行了初步尝试，并为今后的活体动物 实毅莫定了基础。同时，说明荃因治疗有望成为1型摘尿病的一条有 效，疗，:1 关健切:人腆岛索原羞因 逆转录病份级体 肠质体转染 墓因治疗 ~ 2~ Abstract IS a Type1diabetesmellitus,whichislackofinsulinabsolutely, kindofmetabolicdiseasescausebysutoimmunedestructionofpancreatic in is b-cellsintheisletsofLangerhans.Commonly,exogenousinsul appliedtothetreatmentoftype1diabetes.But,thistherapyisnotaccord withthephysiologicaldemandsdu