XPD通过P53抑制乙型肝炎病毒复制、HBx表达和肝癌增殖.pdfVIP

摘要 摘要 i fi thri n— 第一部分：重组质粒pEGFP-N2／XPD转染条件的优化及P Q孵育条件的优化 目的： 本部分为探讨XPD与P53两者对HBV复制、肝癌细胞增殖凋亡以及HBx 表达的影响，所以事先有必要优化重组质粒pEGFP-N2／XPD的转染条件和 Pifithrin吨的孵育条件。 方法： 将HepG2．2．15细胞种植于6孔板中。种板后第2天，利用脂质体转染法将 瞬时转染细胞。转染后48h收获细胞，进行RT-PCR和Westernblot以检测XPD 表达的变化。将重组质粒pEGFP-N2／XPD以上述得出的最佳浓度转染细胞，转 h、24h、48h、72h及96 染后分别孵育0 h收获细胞，进行RT-PCR和Westem blot以检测XPD表达的变化。用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白报告基因表达情 孵育细胞12h，然后进行MTT检测。以上述得出的最佳浓度的Pifithrin．(It分别 孵育细胞0h、12h、24h、36h及48h，然后进行MTT检测。 结果： 1．质粒转染浓度的优化 RT-PCR和Western blot结果显示，XPD的表达在质粒浓度分别为每孔099、 差异(P0．05)，即质粒浓度达到4p∥孔以后XPD的表达不再随浓度的增加 而继续升高。因此，在后续的实验中选定4p∥孔为质粒转染的浓度。 2．质粒转染后细胞孵育时间的优化 RT-PCR结果显示，XPDmRNA的表达在质粒转染后细胞孵育时间分别为0 11 摘要 h、72h、96 h、24h、48 h范 h范围内呈时间依赖性升高(尸0．05)，而在48 mRNA的表达为最高(尸 h时XPD 围内呈时间依赖性降低(P0．05)，其中48 O．05)。Westernblot结果显示，XPD蛋白的表达在质粒转染后细胞孵育时间分 h时 别为0h、24h、48h、72h范围内呈时间依赖性升高(尸O．05)，而在96 h时XPD蛋白的表达为最高(PO．05)。在后续的 回落(PO．05)，其中72 实验中选定48h为质粒转染后细胞孵育时间。 3．质粒转染成功的鉴定 转染48h后，在荧光显微镜下，可在转染了重组质粒pEGFP-N2／XPD和空 载质粒pEGFP．N2的细胞中观察到绿色荧光，而未转染质粒的细胞则未见绿色 荧光，即转染成功。 4．Pifithrin-a孵育浓度的优化 Pifithrin-a浓度达到20rtM以后细胞增殖活力不再随浓度的增加而继续升高。因 此，在后续的实验中选定201．tM为Pifithrin--a的孵育浓度。 5．Pifithrin-a孵育时间的优化 h、12h、24 MTT结果显示，A值在Pifithrin-a孵育时间分别为0h范围内 呈时间依赖性升高(PO．05)，其中24h时A值为最高(尸O．05)。而孵育时 间为为24h、36h、48h三者之间相比，A值无统计学差异(尸0．05)，即 Pifithrin--a孵育时间达到24h以后细胞增殖活力不再随孵育时间的增加而继续升 高。因此，在后续的实验中选定24h为Pifithrin-a的孵育时间。 结论： 本部分确定，在后续的实验中，将以浓度为4肛∥孔的pE