17q21区域发育性髋关节脱位易感基因定位、鉴定与初步功能研究.pdfVIP

·中文论著摘要· 17q21区域发育性髋关节脱位易感基因的 定位、鉴定与初步功能研究 刖 舌 ofthe 发育性髋关节发育不良 Developmentaldysplasiahip，DDH 是小儿骨 科常见的先天畸形之一。发病率在不同的人群中有较大差异，在拉普人和美国土 著人的发病率约为25---一509,，而非洲人群则明显降低。在我国发病率约为1．1～ 3．8960，北方略高些。DDH作为一种常见的危害出生人口健康的疾病，其病因不清， 认为是遗传因素和环境因素共同作用的结果。其中，遗传因素发挥主要作用，但 目前DDH的致病基因尚未明确定位。 前期，本课题组应用传递不平衡检验 Transmissiontest,TDT disequilibrium 近可能存在DDH的易感基因。因此，本研究中我们继续在D17S1820附近选择多 个STR遗传标记，采用TDT方法，对DDH的易感区段进行定位；并选择该区域 内可能与DDH的发生相关的基因，进行突变筛查及初步的功能研究，力争在分子 水平揭示DDH的发病机制。 方法 本研究所涉及的DDH核心家系及正常对照儿童的外周静脉血均来自中国医 科大学附属盛京医院,bJD骨科。所有患儿均经临床及影像学确诊，畸形性髋脱位、 神经源性髋脱位及综合征性俄脱位被排除在外。所有外周血的留取均已征得家长 的同意，并告知用于科学研究的目的。本课题的研究已经中国医科大学附属盛京 医院医学道德伦理委员会的批准。 一、17q21区域DDH易感基因的定位 DDH核心家系的309名成员进行基因分型，并进行TDT检验。同时，在100名 正常人中，对有意义的STR位点进行群体遗传学分析，计算其等位基因频率、基 衡检验。以评价所选用的STR位点在中国东北汉族人群中是否达到了遗传平衡， 为以后的疾病关联分析奠定基础。 二、COLlAl基因转录调控区突变筛查 选择上述已定位的区域内，可能与DDH的发生相关的COLlAl基因作为候 109个DDH患儿中分别进行PCR扩增，扩增产物直接测序。有基因变异的患儿， 对其父母及100个正常儿的该段启动子也进行PCR扩增、测序，以确定变异位点 的性质。 三、COLlAl基因启动子区突变对其表达的影响 通过上述基因突变筛查，检测到了COLlAl基因转录调控区．106位碱基存在 C_T杂合突变。为进一步明确该突变在COLlAl基因转录调控水平的作用，采用 定点突变的方法，构建了COLlAl基因启动子的野生型和突变型荧光素酶报告基 因表达载体，转染成纤维细胞，通过比较表达的荧光素酶活性，明确该突变在转 录水平对COLlAl基因表达的影响。 列，片段长度为1060bp。 PGL3．COLlAl表达载体。 载体，构建突变型的PGL3．COLlAl表达载体。 3T3细胞。细 4、用构建好的两种表达载体及PGL3-basic分别瞬时转染NIH 2 胞培养48小时后，测定各组细胞表达的荧光素酶的相对活性，以明确COLlAl 启动子区．106位碱基C—T突变对基因转录调控的影响。 结 果 一、17q21区域DDH易感基因的定位 一 正常人群STR位点多态性分析 100名无血缘关系的个体中，在D17S810位点只检测到两个等位基因；在 D17S931位点，虽然检测到了7个等位基因和9种基因型，但其杂合度仅为41．13％， 多态信息含量仅为O．3816，这两个位点不能提供足够的多态信息。其余9个STR 位点的多态信息含量均在o．5以上，具有良好的多态性。同时，经矿检验，各位 这两个基因座是在东北汉族人群中进行疾病的连锁分析、基因定位等研究最理想 的遗传标记。 二 TDT检验结果 个STR多态位点在103个核心家系中的基因型分析结果符合孟德尔遗传模式。 D17S790之间的约11．70Mb的范围内。 二、COLl A1基