高效液相色谱法检测白藜芦醇及其糖苷四种异构体.docVIP

高效液相色谱法检测 白藜芦醇及其糖苷四种异构体 曾 玮 马志玲* 中山大学化学与化学工程学院，分析科学研究所 广州 510275 摘要 本实验建立了RP-HPLC法同时分离测定白藜芦醇及其糖苷四种异构体的方法，将方法用于 红葡萄酒中白藜芦醇及其糖苷的四种异构体、虎杖中反式白藜芦醇及其糖苷的分析测定获得满意的结果。以Hypersil ODS2（5μm I.D. 4.0mm×200mm）色谱柱，用甲醇，水作为流动相进行梯度洗脱，二极管阵列检测器在306nm(反式白藜芦醇及苷)，288nm(顺式白藜芦醇及苷)检测，白藜芦醇及其糖苷的四种异构体在30min内得到较好的分离。确定了提取红葡萄酒中白藜芦醇及其糖苷的四种异构体的最佳预处理方法，在pH=2的条件下，以乙酸乙酯为溶剂可获得最佳萃取效果，此方法用于5种不同的红葡萄酒中，白藜芦醇及其糖苷的回收率分别为94.6%、97.8%。使用微波破壁-溶剂提取-高效液相色谱法测定虎杖中的反式白藜芦醇及其糖苷，大大简化了分析步骤。 关键词 高效液相色谱法 ，葡萄酒，虎杖 前言 白藜芦醇[（Resveratrol）是植物体内产生的天然二苯乙烯类多酚物质，一种天然活性成分。在自然条件下，白藜芦醇主要以其糖苷的形式存在，糖苷可以分解为白藜芦醇。白藜芦醇及糖苷分子中，其连续环状分子中的双键能够在紫外光或其它物理化学因素的诱导下发生几何异构,存在白藜芦醇及其糖苷的4种异构体，即反式白藜芦醇(trans-resveratrol)，顺式白藜芦醇(cis- resveratrol)，反式白藜芦醇-3-O-β糖苷(trans-resveratrol glucoside)和顺式白藜芦醇-3-O-β糖苷(cis- resveratrol glucoside)，其结构如图1。 反式白藜芦醇 顺式白藜芦醇 反式白藜芦醇-3-O-β糖苷 顺式白藜芦醇-3-O-β糖苷 图1白藜芦醇及其苷的异构体化学结构图 白藜芦醇及白藜芦醇苷具有抗癌、预防动脉粥样硬化、抗细菌、抗真菌、抗休克、镇咳平喘等多种药理作用。可以使用气相色谱[1]、毛细管电泳法[2]和高效液相色谱[3~5]对其进行分离测定。本文采用高效液相色谱法分别对葡萄酒和中草药虎杖中白藜芦醇及其糖苷进行分析。本实验以葡萄酒作为研究对象，在比较固相萃取法和液液萃取法的萃取效率的基础上，提出了乙酸乙酯作为萃取剂的液液萃取法同时萃取红葡萄酒中白藜芦醇及其苷的四种异构体是最好的前处理方法，优化了乙酸乙酯萃取红葡萄酒中白藜芦醇及其苷的四种异构体的最佳条件，使用液液萃取法—HPLC法对5种红葡萄酒中白藜芦醇及其苷的四种异构体进行了分离测定。本文还采用微波破壁—溶剂提取—HPLC法直接测定虎杖中白藜芦醇及其糖苷反式白藜芦醇及其糖苷，与传统的溶剂浸取方法相比较，大大简化了分析步骤，获得满意的结果。 实验部分 2.1 仪器 配有二极管阵列检测器的1100型高效液相色谱仪 （Agilent公司）， 化学工作站（Agilent ChemStation for LC 3D），QW-2HO型多管微波机（箱式）,ZF-3型三用紫外仪，旋转蒸发仪。 2.2 试剂 反式白藜芦醇纯品（经HPLC检验纯度99.99%，Sigma公司）；反式白藜芦醇苷纯品（经HPLC检验纯度99.9%，北京迪尔塔金生物有限公司）；顺式白藜芦醇及其糖苷的标准品由经紫外光照射其相应的反式化合物获得。甲醇（HPLC级，MTEDLA ）, 流动相所用水为双蒸水；其余试剂均为分析纯。 2.3色谱条件 色谱柱（依利特公司）Hypersil ODS2 （5(m I.D. 4.0mm×200mm），并配有C18保护柱；流动相为 MeOH和H2O，采用下列梯度淋洗方式分别分离测定红葡萄酒和虎杖中白藜芦醇及其糖苷的4种异构体，（1）红葡萄酒的梯度洗脱程序：0~15min 10%~22%、15~25min 22%~50%、25~34min 50%~66% ( MeOH 浓度，v/v)，（2）虎杖的梯度洗脱程序：0~20min 20%~60%、20~30min 60%~100% ( MeOH 浓度，v/v)；柱温30℃； 流速0.8mL/min；检测波长分别为288nm（顺式白藜芦醇和苷）、306nm（反式白藜芦醇和苷）；进样量：10? L。在上述色谱条件下，白藜芦醇及其糖苷的4种异构体的色谱分离图如图2。 图2①梯度B分离白藜芦醇及其苷四种异构体的色谱图② 梯度A分离白藜芦醇及其苷四种异构体的色谱图 A——反式白藜芦醇苷，B——反式白藜芦醇，C——顺式白藜芦醇苷 ， D——顺式白藜芦醇；色谱条 件如正文。 2.4 实验方法 1．红葡萄酒中白藜芦醇及其糖苷的4种异构体的分离测定 取适量