第五章 色谱分析法-2.docVIP

§4 高效液相色谱法 一、概述 1、定义 在经典液相色谱法基础上，吸收了气相色谱法的理论，并采用高压输液泵、高效固定相和高灵敏度检测器等装置的色谱技术称为高效液相色谱法，又称为高压液相色谱法。 2、特点 ①高压 由于液体的粘度比气体大得多，所以，当液体流动相通过色谱柱时会受到很大的阻力，需采用高压泵对载液施加压力，压力可达100～350×105Pa。 ②高速 流动相在柱中的流速大，分离速度快，一次分析只需几分钟至几十分钟就能完成。分析时间比经典液相色谱法短得多，与气相色谱法近似。 ③高效 使用了新型固定相，柱效远高于气相色谱法。另外，流动相可进行选择，有单溶剂、多元溶剂，并可任意调配比例，可改变流动相的组成、极性、pH值等性质，因此改善了分离效果。而气相色谱法的流动相种类少，性质相近，且与组分之间不发生特殊作用，故改变载气种类不能很大地改善分离效果。该法分离温度远低于气相色谱法，更有利于分离。 ④高灵敏度 采用高灵敏度的检测器，提高了分析灵敏度，如紫外检测器的灵敏度可达5×10－10g·mL－1。 ⑤应用范围广 一般对能制成溶液的试样均能分析，尤其适用于分析高沸点、大分子、热稳定性差、强极性化合物和各种离子型化合物，如分离分析氨基酸、蛋白质、维生素、生物碱、糖类、农药等。而气相色谱法无法分析高沸点（300℃以上）或不能汽化的物质。 ⑥液相色谱易实现分离后样品中各组分的收集（高纯物制备）。 二、 高效液相色谱仪 高效液相色谱仪包括高压输液泵、梯度淋洗装置、进样装置、色谱柱、检测器和记录系统，见图。 贮藏器中贮存的流动相经过高压泵送到色谱柱冲洗柱子，当柱子平衡而且基线平直后，试样用注射器进入进样口，由流动相把试样送到色谱柱进行分离，分离后的组成由检测器检测，输出的信号通过放大器放大后用记录仪记录下来。若需进行进一步分析，在色谱柱出口可将流出物收集起来。 1、高压输液泵 高压输液泵是用来输送流动相的，它是高效液相色谱仪的重要部件。按泵的性质分为恒流泵和恒压泵两类。 恒流泵： 恒流泵是目前使用最多的，有往复泵和螺旋泵。 往复泵使用广泛，它的优点是输出流量恒定，且与流动相的粘度及色谱柱的阻力无关，死体积小，保留值的重复性好，并适合于梯度淋洗，缺点是输出液流量有脉动。 恒压泵： 常用的恒压泵为气动放大泵，输出压力恒定，流量无脉动，能迅速获得高压，适合于色谱柱的填充，价格低；缺点是流量与流动相粘度和色谱柱的阻力有关，所以流量不恒定；泵的腔体大，改变流动相较麻烦，不适宜于梯度淋洗。 2、梯度淋洗装置 对于某些复杂样品，组分的值范围很宽，用一种强度的溶剂淋洗时往往不能满足要求，可采用梯度淋洗——即在分离过程中，组成流动相的两种或两种以上不同的溶剂，按一定程序连续改变配比、极性、pH值和离子强度，从而达到提高分离效果和分析速度的目的，梯度洗脱技术类似于气相色谱中的程序升温技术。两者都是为了使各组分在最佳值下流出柱子（不同的是程序升温通过改变柱温，而梯度淋洗是通过改变流动相）。 梯度淋洗有两种装置：一种是低压梯度，在常压下按一定程序将不同的溶剂混合后再用高压泵输入色谱柱；另一种是高压梯度，用两个高压泵将不同的溶剂按一定比例压入混合室混合，再送入色谱柱。 3、进样装置 将样品送入色谱柱中进行分离。由于高效液相色谱柱子较短（一般小于0.3m），固定相颗粒较细，进入柱中的样品在流动相中扩散越厉害，则色谱峰就越宽，因此，进样时要求样品在到达柱头前，不与流动相相混合，直接注射到柱头中心即所谓“点进样”。进样方式通常有两种：一种是注射器进样，同气相色谱法，优点是装置简单，可改变进样量，缺点是不能承受高压；另一种是进样阀进样，与气相色谱法中的六通阀一样，优点是能承受高压，重现性好，易于自动化，缺点是改变进样体积时较麻烦。 4、色谱柱 色谱柱是色谱分离的核心。常采用填充柱，固定相同气相色谱法，此处介绍色谱柱管。 要求柱管耐高压、耐腐蚀。一般采用厚壁的玻璃管或不锈钢管制成，柱内径为1～6mm，柱长为15～30cm，直形柱。 5、检测器 检测器分为两类 通用型检测器（总体性质检测器）：它是连续测定柱后流出液（流动相加溶质）总的物理性质的变化，如示差折光检测器、电导检测器等。因适用范围广，但是由于它对溶剂（流动相）也有响应，因此易受温度、流量变化的影响，造成较大的噪声和漂移，不能用于梯度淋洗，灵敏度较低，不适于痕量分析。 选择性检测器（溶质性质检测器）：它是测定流出液中溶质（待测组分）的物理性质的变化，对流动相无信号，如紫外吸收检测器和荧光检测器等。这类检测器只对某些待测物质有响应，灵敏度高，受外界影响小，可用于梯度淋洗，但应用范围受限制。 a、紫外可见吸收检测器 高效液相色谱仪中使用最广泛的选择性检测器。作用原理是待测组分对特定