犬细小病毒VP2蛋白稳定表达细胞系的建立论文.docVIP

摘 要 犬细小病毒病是由犬细小病毒（Canine parvovirus, CPV）引起的一种急性传染病。 此病以主要表现急性出血性胃肠炎和急性心肌炎。此病传染性强，发病率和死亡率高， 是一种危害犬，特别是幼犬的一种重要传染性疾病。 人们研究证明宿主细胞膜上的转铁蛋白受体( Transferrin receptor, TfR) 是犬、猫 等动物细小病毒侵入宿主细胞的受体。在感染过程中，病毒的衣壳蛋白 VP2 可以与 宿主细胞膜 TfR 结合，在该受体介导下通过依赖 dynamin 和 clathrin 介导的内吞过程 使病毒侵入宿主细胞。 为了在分子水平上研究 VP2 与 TfR 的相互作用，需要制备 VP2 蛋白。为获得大 量具有生物活性的 VP2 蛋白，我们选用真核表达系统。采用人的 CD5 信号肽构建了 VP2 分泌型表达载体，并利用 CHO-K1 细胞建立了 VP2 蛋白稳定表达细胞系。 首先通过酶切从含有人 CD5 信号肽序列的质粒中将 CD5 信号肽片段切出，分离 纯化酶切片段，并将其克隆到 pcDNA3.1A 的多克隆位点上，再转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞，经过酶切鉴定筛选出阳性克隆，测序正确的重组质粒命名为 pcDNA3.1-CD5sp。 然后根据 GenBank 中 CPV 的 VP2 序列（AB120727）设计 1 对引物，通过 PCR 方法从含有 VP