草莓镶脉病毒(SVBV)启动子的鉴定的研究.pdfVIP

中文摘要 启动子是基因表达调控的重要元件，它能够启动下游基因的转录。本研究克 隆了中国草莓镶脉病毒（Strawberry vein banding virus ，SVBV ）全长启动子以及 该启动子的缺失突变体。构建系列启动子植物表达载体，利用 gus 与gfp 两种报 告基因鉴定了 SVBV 启动子的驱动强度和表达类型。结果表明，SVBV 全长启动 子的驱动活性高于对照花椰菜花叶病毒（Cauliflower mosaic virus , CaMV ）35S 启动子。本研究鉴定了一个新的植物病毒启动子，将为植物基因工程提供一种新 的工具。 1. SVBV 全长启动子及其缺失突变体的克隆与植物表达载体的构建 设计特异性引物分别扩增 SVBV 全长启动子及其 2 个缺失突变体序列，克 隆并测序，SVBV 全长启动子（SVBV P1 ）序列长度为984 bp，2 个缺失突变体 为核心启动子（SVBV P2）和缺失上游调控区启动子（SVBV P3 ），长度为324 bp 和 819 bp。 将 SVBV P1、SVBV P2 和 SVBV P3 分别与 pINT121 载体 gus 基因前的 35S 启动子置换，获得植物表达载体 pINT P1 、pINT P2 和 pINT P3 。再将 SVBV P1 和美国 SVBV 全长启动子分别与 pCHF3 载体 gfp 基因前的 35S 启动子置换，获 得植物表达载体 pCHF P1 和 pCHF P5 。 2. 植物表达载体以根癌土壤杆菌介导进行瞬间表达 将启动子系列表达载体 pINT P1 、pINT P2 、pINT P3 、pINT P4 、pINT P5 和 pINT121 电击导入根癌土壤杆菌，菌液注射本氏烟茎部，组织化学染色进行启动 子活性的定性鉴定；同样将表达载体 pCHF P1 、pCHF P5 和 pCHF3 分别电击导 入根癌土壤杆菌，菌液注射本氏烟茎部，通过荧光显微镜观察鉴定各启动子的活 性。再用根癌土壤杆菌菌液浸润本氏烟叶片，利用 gus 荧光光度测定法进行启动 子活性的定量分析，鉴定不同启动子活性强弱。 3. 瞬间表达中gus 活性的组织化学检测和gfp 荧光活性观察 利用组织化学染色法鉴定启动子的活性，染色结果表明，在 pINT P1 、pINT P2 、pINT P3 、pINT P4 、pINT P5 和 pINT121 表达的植株茎部的维管组织和部分 皮层细胞均能观察到蓝色位点，说明各启动子都能驱动 gus 基因在植物细胞中表 达。从各切片的 gus 染色强度上来看，pINT P1 的启动子驱动gus 基因的表达水 平要高于阳性对照 pINT121 的 35S 启动子。 利用荧光显微镜观察启动子的活性，荧光观察表明，在 pCHF P1 和 pCHF P5 和 pCHF3 表达的植株维管组织均能观察到绿色荧光，说明各启动子均能驱动 gfp I 基因在植物细胞中表达。从各切片的 gfp 荧光强度上来看，pCHF P1 中gfp 基因 的表达水平要高于阳性对照 pCHF3 。用根癌土壤杆菌菌液注射本氏烟的植株作 为阴性对照，茎杆切片中几乎观察不到绿色荧光。 4. 瞬间表达中gus 荧光活性分析 荧光光度法测定结果表明，pINT P1 的平均相对gus 活性最高，达 pINT121 的280% 。pINT P2 、pINT P3 、pINT P4 、pINT P5 的gus 活性分别为 pINT121 的 29% 、87%、125%和 162%，与pINT P1 差异显著 （P0.05 ）。以根癌土壤杆菌菌 液浸润本氏烟叶片作为空白对照，几乎没有 gus 表达活性。 5. 转基因普通烟 gus 活性的组织化学检测 转基因普通烟幼苗的 gus 组织化学染色分析表明，pINT P1 、pINT P5 和 pINT121 转基因植株的叶片蓝色最深，而茎杆和根部蓝色相对较浅，说明 SVBV 启动子和 CaMV 35S 启动子驱动gus 基因均在叶片组织中表达强度最高。茎横切 面组织化学染色表明，pINT P1 转基因烟草的茎横切面蓝色比对照 pINT121 深， 说明中国 SVBV 启动子驱动gus 基因稳定表达的活性高于 CaMV 35S 启动子。另 外，SVBV 启动子与 CaMV