基于哺乳动物单杂交技术ERα调节剂高通量筛选模型的建立及….pdfVIP

生物工程学报 Chin J Biotech 2009, July 25; 25(7): 1088- journals . Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061 cjb@ © 2009 Institute of Microbiology, CAS CSM, All rights reserved 生物技术与方法 基于哺乳动物单杂交技术ERα 调节剂高通量筛选模型 的建立及应用 1 1 2 1 1,2 2 1 2 2 张倩, 水小溪 , 范玉玲, 郝伟丽 , 郑智慧 , 路新华 , 赵宝华 , 张华, 贺建功 1 河北师范大学生命科学学院, 石家庄 050016 2 华北制药集团新药开发有限责任公司, 石家庄 050013 摘 要: 雌激素受体α (Estrogen receptor α, ERα)是一种类固醇核受体, 在机体的多种生理功能中起关键作用。为了筛选 新的ERα调节剂, 本研究建立一个基于哺乳动物单杂交的报告基因技术的高通量ERα调节剂筛选模型。利用RT-PCR技术 从脂肪组织总RNA 中扩增ERα 配体结合区(Ligand binding domain, ERα LBD )基因序列, 并插入含GAL4 DNA 结合域的 pBIND-GAL4 表达质粒构建pBIND-GAL4-ERα(LBD)的嵌合表达质粒。该质粒与本室已构建好的含GAL4 响应元件和荧 光素酶的报告质粒pGL3-GAL4共转染, 通过测定荧光素酶的活性评价ER调节剂的转录调剂的活性。经过多种条件优 化, 激动剂阳性药对照雌二醇可以剂量依赖地诱导荧光素酶的表达, 最大上调倍增数可达 28.1 倍, EC 50 为 0.17 mol/L 。拮抗剂阳性对照它莫昔芬可以有效地拮抗雌二醇的活性, 最大下调倍数为 6.3 倍, EC 50 为0.1 mol/L 。该筛选 模型可微量化于 384 孔板, 且Z 因子均大于0.5。利用该模型从2000 多个微生物和植物来源的天然产物以及合成化合物 中筛选得到4 个ERα激动剂。该模型灵敏、稳定, 可以快速进行多种来源的ERα调节剂的筛选和活性评价。 关键词: ER α, 激动剂, 拮抗剂, 共转染, 高通量筛选 Development and application of a mammlian one hybrid-based high-throughput screening model for Erα modulator 1 1 2 1 1,2 2 1 Qian Zhang , Xiaoxi Shui , Yuling Fan , Weili Hao , Zhihui Zheng , Xinhua Lu , Baohua Zhao , Hua Zhang2, and Jiangong He2 1 College of Life Sciences, Hebei Normal University , Shijiazhuang 050016, China 2 Drug Research Development Center of North China Pharmaceutical Group Corporation, National Microbial Medicine Engineering Resea