蛋白质间相互作用的研究方法--技术流.pdfVIP

蛋白质间相互作用研究方法 确定各种可能与目标蛋白相互作用的蛋白质 双杂交和其他双成分系统 第一阶段：诱饵-LexA 融合蛋白的鉴定 诱饵-LexA 融合蛋白的构建 1．将编码诱饵蛋白的靶DNA克隆到LexA融合载体的多聚接头处，以合成一种框架内的LexA 融合基因。确定诱饵序列的羧基端存在翻译终止序列。形成的质粒作为pBait。 2．采用下列LexA融合基因和lexAop-lacZ报道质粒的组合，建立一系列EGY48 lexAop-LEU2 选择的转化酵母菌： a. pBait + pMW12（活化测定） b. pSH17-4 + pMW12（活化的阳性对照） c. pRFHM1 + pMW12（活化的阴性对照） d. pBait + pJK101（抑制/DNA 结合测定） e. pRFHM1 + pJK101（抑制的阳性对照） f. pJK101 单独（抑制的阴性对照） 3．将每种转化混合物铺在适宜的选择性缺陷板上：CM(Glu)-Ura-His（针对质粒组合a~e） 或CM(Glu)-Ura（针对质粒组合f）。将培养板在 37℃培养 2~3天以选择含有质粒的转化 酵母克隆。 4．制备转化子的母板。