K5-2DNA和蛋白质技术.pptVIP

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多聚酶链式反应扩增DNA片段 * 专题5 DNA和蛋白质技术 课题2 一、基础知识 1、PCR原理: 与细胞内DNA复制类似 在PCR技术中: ①扩增方向:DNA的合成方向总是从子链的5’端 向3’端延伸。 ②解旋:利用了DNA的热变性原理,通过控制温 度来控制双链的解聚与结合。 ③酶:耐高温的Taq—DNA聚合酶,高温不会失活。 ④条件:一定的缓冲溶液下才能进行,需提供DNA 模板、两种引物、四种脱氧核苷酸、耐热 的DNA聚合酶,同时要控制温度。 2、PCR的反应过程: 每个循环包括:变性 ——复性——延伸 要经历三十多次循环 ①变性(模板DNA解旋) 模板DNA经加热至900C以上。一定时间后, 使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA 解离,使成为单链,以便于它与引物结合, 为下轮反应作准备。 ②复性(退火) 模板DNA经加热变性成单链后,温度降到500C 左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。 ③延伸 DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用 下以脱氧核苷酸为原料,以母链为模板,按碱 基互补配对的原则与半保留复制的原理,合成 一条新的DNA链。 从第二轮循环开始,上一次循环的产物也可 以作为模板参与反应,并且由引物Ⅰ延伸而成的 DNA单链会与引物Ⅱ结合,进行DNA的延伸,这样, DNA聚合酶只能特异性地复制两个引物之间的 DNA序列,使这段固定长度的序列呈指数扩增。 准备好PCR反应体系的配方 用微量移液器按配方在往微量 离心管中加入各组分 盖严盖子,用手指轻轻弹击管 壁混合反应液 离心10s 将离心管放入PCR仪上,设置好 循环程序进行反应 P62表格 二、实验步骤: 三、结果分析与评价 1、反应液稀释: 取2μLPCR反应液,添加98μL蒸馏水; 2、分光光度计调零: 将100μL蒸馏水添加到比色杯中,在260nm 处将分光光度计调整读数为零。 3、测定:将100μL反应稀释液倒入比色杯中,测 定在260nm处的光吸收值。 4、计算:DNA含量=50×光吸收值×稀释倍数 DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰 * * *

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