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肝脏P450还原酶特异性敲除小鼠模型在毒理学中的应用 Application of Liver-specific Cytochrome P450 Reductase knockout mice in Toxicology 肖瑛，武元峰，薛翔，顾军，任进* Xiao Ying, Wu Yuanfeng, Xue Xiang, Gu Jun, Ren Jin 中国科学院上海药物研究所，新药研究国家重点实验室,上海201203 State Key Laboratory for New Drug Research，Shanghai Institute of Materia Medica,Chinese Academy of Sciences, Shanghai, 201203 关键词: NADPH-细胞色素P450酶还原酶，基因敲除，器官毒性 Key Word: NADPH-P450 Cytochrome Reductase, Knockout, Organ Toxicity 1.引言 微粒体细胞色素P450单加氧酶（P450，CYP）在内源与外源性化合物的生物转化中起着重要的作用。P450酶蛋白种类的多样性及其底物的重叠性使P450酶系可以催化多种类型的反应，不仅对许多外来物质如杀虫剂及环境有毒物质具有代谢作用，还参与一些起重要生理功能的内源性物质如激素、脂肪酸的代谢。P450酶的功能与生物学作用的重要性，使其研究具有广阔的应用前景。通过调控其表达和活性，可望改变生物体内外源性化合物尤其是药物的代谢，对于药物的研究和开发也有重要的意义。由于P450酶系的生物学重要性，自其发现以来，该酶系的研究一直是药理学和毒理学中一个十分引人注目的领域。 P450酶基因的多态性使其有多种亚型且多具有类似的功能和相似的组织分布特征，使在一个特异组织中很难去区别单个P450酶亚型的功能。目前已有多个P450酶亚型敲除（knockout，KO）小鼠模型，这些模型已被广泛用来研究特异性P450酶亚型在外源性化合物的代谢和毒性中的作用[[1]]。然而这些KO模型都只能是针对同源性较小的P450酶亚型，对于同源性较大的亚型较难敲除；而且由于目前对于小鼠Cyp基因的调控、底物特异性以及小鼠Cyp基因的种属差别等方面还没有较全面的认知，所以对于很多P450酶亚型来说此种敲除方法是不可行的。Hildebrandt等提出NADPH-细胞色素P450还原酶（CPR/POR）是所有微粒体P450酶的氧化还原搭档[2]，它提供P450酶氧化还原反应所需的第一个电子。基于这个原理，策略之一就是开发一个靶向敲除P450还原酶-Cpr基因的小鼠模型，其表达的缺失将抑制所有微粒体P450酶的活性。并且由于CPR在胚胎发育中具有重要功能，所以只能采用条件敲除（conditional knock）的手段来得到Cpr基因敲除小鼠模型。通过条件敲除方法已经得到肝脏CPR特异性敲除小鼠模型[3]，肺脏CPR特异性敲除小鼠模型[4]，心脏CPR 特异性敲出小鼠模型[5]和全身低表达CPR的小鼠模型[6]，这些敲除小鼠模型在化合物的毒性机制研究中有着广阔的应用前景。 2.肝脏CPR特异性敲除小鼠模型概况 英国和美国的两个研究小组分别应用（conditional knockout）条件敲除的手段（图1）建立了肝脏CPR特异性敲除小鼠模型 [3, 7]。该模型将限制性内切酶酶切位点标记在Cpr基因两侧，并在肝脏中特异性表达可以识别该位点的Cre酶，从而使小鼠在发育过程中肝脏Cpr基因被逐渐敲除导致CPR蛋白表达的缺失，最终使得肝脏P450酶活性丧失。其主要特征为： 图1 肝脏CPR特异性敲除小鼠模型建立方法图解 2.1 繁殖能力以及一般特征 肝脏CPR特异性敲除小鼠（Cpr-Null）小鼠交配繁殖的结果表明它们可繁育，产仔数平均为6仔/窝，无胎致死性。Null小鼠在被毛颜色、一般外观及日常活动都表现正常。 2.2 组织特异性Cpr基因敲除 肝脏CPR表达的缺失通过免疫印迹可见3周时在Null小鼠肝脏微粒体CPR蛋白表达减少为野生型小鼠（wild-type，WT）的约18%，2个月大时Null小鼠肝脏中已经检测不到CPR蛋白（图2）。因此，2个月大时纯合子中的CPR表达基本已经缺失。另一方面，妊娠第14天时检测鼠胚时，未观察到CPR蛋白水平的改变。同时在2个月大时在此两种小鼠的肺、肾、脑和鼻粘膜中微粒体中CPR蛋白表达水平无显著差异，再次证实了Cre表达的组织特异性以及CPR缺失的特异性。 图2 CPR蛋白的表达 2.3 CPR表达的降低对微粒体CYP和HO活性的影响 蛋白活性检测结果表明2个基因型间肝微粒体CPR的活性的差别与CPR蛋白水平的差别相一致，随着肝脏CPR蛋白表达水平的下降，