分子生物学基本研究法(上)--DNA、RNA及蛋白质操作技术.pdfVIP

第 五 章 分子生物学基本研究法 （上）DNA、RNA及蛋白质操作技术 扉页： 当你进入实验室时，要像脱去外衣那样 放下你的想象力，因为实验操作中不能有一 丁点儿的想象，否则，你对事物的观察就会 受影响；当你翻开书本的时候，你又必须尽 可能展开想象的“翅膀”，否则，你就不可 能走在别人的前面。 现代分子生物学的快速发展，得益于上个世 纪中叶以来研究方法、特别是基因操作和基 因工程技术的进步。 基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、 杂交、电泳、细胞转化、核酸序列分析以及 基因人工合成、表达、定点突变和PCR扩增 等，是分子生物学研究的核心技术。 基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或 其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入 原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的 繁殖和表达。 基因工程技术是核酸操作技术的一部分，只不过它 强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的 繁衍与性状表达。 事实上，这种跨越物种屏障、把来自其它生物 的基因置于新的寄主生物细胞之中的能力，是 基因工程技术区别于其它生命科学技术的根本 特征。 重组DNA技术发展史上的重大事件 三大成就： 一、在20世纪40年代确定了遗传信息的携 带者、即基因的分子载体是DNA而不是蛋白 质，解决了遗传的物质基础问题； 二、50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模 型和半保留复制机制,解决了基因的自我复 制和世代交替问题； Generalized model of semiconservative replication of DNA. New synthesis is shown in blue. 三、50年代末至60年代，相继提出了 “中心法 则”和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，阐 明了遗传信息的流动与表达机制。 5.1 基因操作的基本工具 （一）限制性核酸内切酶 能够识别DNA上的特定碱基序列并从这个位 点切开DNA分子。 第一个核酸内切酶EcoRI是Boyer实验室在 1972年发现的，它能特异性识别GAATTC序 列，将双链DNA分子在这个位点切开并产生 具有粘性末端的小片段。 图5-1 几种主要DNA 内切酶所识别的序列及 其酶切末端。 Restriction endonucleases (restriction enzymes, RE) recognize a specific nucleotide sequence and cut both strands of the DNA within that sequence. Werner Arber, Hamilton Smith and Daniel Nathans were awarded the 1978 Nobel Prize for their work on REs. RE 切割随机DNA分子（假定4种碱基在DNA 中均匀分布）的概率由该酶所识别的碱基数 目按照4n 来计算，如一个6碱基切割酶平均每 6 4096 bp核DNA有一个酶切位点（4 ），而一 个4碱基切割酶平均每256 bp核DNA就有一个 4 酶切位点（4 ）。 （二）基因克隆的载体 载体三要素： • 自我复制能力； • 携带外源基因片段大小； • 插入位点多少； 易于鉴定识别程度。 大肠杆菌质粒载体: 1、pSC101质粒载体 • 低拷贝数严紧型复制控制的大肠杆菌质粒载 体，平均每个寄主细胞仅有1~2个拷贝。 r • 长9.09kb ，带有四环素抗性基因 （tet ）及 EcoRI 、HindIII 、BamHI 、SalI 、XhoI 、 PvuII 以及SmaI等7种限制性核酸内切酶的 单酶切位点，在HindIII 、BamHI和SalI等3 r 个位点插入外源基因，会导致tet 失活。 大肠杆菌 pSC101 质粒载体