大孔硅胶化学键合固定相用于蛋白质分离的反相高效液相色谱.pdfVIP

研究报告 大孔硅胶化学键合 固定相用于 蛋 白质分 离 的反相 高效液 相色谱 刘克里 张任恩 孙日明 路凤琴 （中国科学院化学研究所，北京） 天（津化学试剂二厂） 提〔要〕研制不同孔径的硅胶，并进行了C1烷基化学键合。探讨了硅胶孔径对蛋白质的 保留、分离和回收率的影响。实榻结表明，硅胶孔径对蛋白质分离的闹柱率有重要影跋响 然而，对本实验中绝大多数蛋白质，在不孔径柱上，其浔保羰时间基本保３持植变。蛋白实的 回收率随硅胶孔径增大而有所提高。此外，尚考察了流动相中有机溶剂的浓度对牛血清白蛋 白B（SA）保留的影响。 反相色谱作为液相色谱应用最广泛的一 个分支，近年来在多肽和蛋白质难研究中也 实 验 部 分 受到很大重视1〔,2。然而，由于蛋白质分子 仪器：日立635-A型液相色谱仪，包括 具有大的分子体积，不同的带电或极性官能 梯度程序仪、进样阀、紫外一可见波长可调 团以及其构象上的异变性等特点，故其保留 检测仪及835型微处理机。 行为和适宜的分离条件，均与一般有机小分 试剂及药品：硅胶 （5m ，青岛海洋 子的分离有所不同。有关硅胶孔径3,4、化 化工厂；磷酸二氢钠，异丙醇 经（精馏取 学键合相的性质4〔-6〕以及流动相组成7,〔8〕对 81.5 82馏分），北京化工厂，分析纯； 蛋白质的保留、分离效率和回收率的影响已 水为二次蒸馏水。细胞色素CCyt 胰凝 有报道。 乳蛋白酶原C（hy，牛血清白蛋白B（SA， 上述诸因素中，起重要作用的因素是硅 Serva卵清蛋白（Ova），Polyscience 猪、 胶孔径。目前，一般商品液相色谱固定相所 牛胰岛素 （InsSigma；血红蛋白-链 H（b- 用硅胶平均孔径为6-10nm，此种固定相对 链），医学科学院基础所。 于分子量较小蛋白质 分（子量＜10 15KD 实验方法：大孔硅胶键合相制备：将5 仍能得到较好的分离。但对于分子量较大的 微米细孔硅胶经氯化锂-氯化钠混合盐溶液 蛋白质，由于其不能自由扩散通过硅胶细孔 浸泡后，120℃烘干，通过控制焙烧条件，制 和产生不可逆吸附等因素，造成柱效率和回 得不同孔径的大孔硅胶。将所得大孔硅胶用 收率下降。 蒸馏水洗去复盐并用20パ ％盐酸处理后，洗至 我们用细孔硅胶焙烧扩孔制得大孔硅 中性，在120℃真空干燥8小时，然后同C18 胶，然后通过化学键合制成C1烷基键合相。 烷基三氯硅烷反应，最后用三甲基氯硅烷处 以标准蛋白质为样品，以此大孔硅胶化学键 理残留硅醇基。 合相对蛋白质的分离效率、回收率以及色谱 色谱条件及操作：不锈钢色谱柱4 150 保留的某些特点进行了考察，并与通用的硅 mm，将固定相悬浮于四氯化碳与二氧六环 胶化学键合固定相进行了比较。 2:1，V/V混┗合悬浮液中，经过超声波分散 3分钟，在4.9 107Pa压力下填充柱子。色谱 表1所示。从表1可以看出，C18-2102）和 分离采用梯度淋洗方法。流动相 A（:20％异 C18-6003）与一氯硅烷键合的配位基密度是 丙醇0.1molLNaH2PO4缓冲液，pH2.2；流 相近的9〔〕。此两种固定相经过4.9 107Pa耐 动相B（:60％异丙醇0.1molLNaH2PO4缓 压考察，其机械强度是好的，特别是C18- 冲液，pH22。线性梯度，时间30min流速 600没有因扩孔而不耐高压10。以联苯 0.5mlmin紫外280nm检测。回收率测定，每 Biph）为样品，甲醇:水 8（0:20，V/V）为流 种蛋白质在给定异丙醇浓度的NaH2PO4缓 动相，分别测柱效，C18-210N=25300塔板／ 冲体系下，通过柱子，由微处理机测其峰面 m，C18-600N