牛病毒性腹泻病毒Real-timePCR方法的建立及其应用.pdfVIP

特 产 研 究 SpecialWildEconomicAnimalandPlantResearch 文章编号：1001—4721(2014)03—0001—04 牛病毒性腹泻病毒 Real—timePCR方法的建立及其应用 张淑琴，谭斌，李鹏，杨勇，孙娜，王凤雪，郭利，温永俊，程世鹏※ (中国农业科学院特产研究所特种经济动物分子生物学国家重点实验室 ，长春 ]30112) 摘要：本研究在牛病毒性腹泻病毒5UTR基因的保守区设计并合成了1对引物，建立了可以定量检测牛病毒性腹泻病毒核酸 的SYBRGreenI荧光定量 PCR方法。该方法建立的标准曲线相关系数 R 为0．999，扩增效率为 95．9％，熔解曲线为单一峰 值，可检测到初始模板中4．1×10copies／tlL的牛病毒性腹泻病毒核酸，是常规 lit—PCR方法敏感性的 100倍。该检测方法与 猪瘟病毒、传染性鼻气管炎病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛副流感病毒3型病毒等其它牛源病毒均不发生交叉反应；批内与批 间重复性试验变异系数均小于2．2％。本试验建立的荧光定量 PCR检测方法可用于牛病毒性腹泻病毒的临床诊断。同时，应 用本方法对临床病例的各组织器官进行了病毒 RNA定量检测结果表明，胸腺等淋巴组织的病毒含量最高，证实病毒主要侵害 淋巴器官，此研究可为临床病例的病毒分离提供借鉴。 关键词：牛病毒性腹泻病毒；病毒检测；荧光定量聚合酶链反应 中图分类号：$852．659．6 文献标识码：A DevelopmentofaReal—timePCR AssayforDetectionof BovineViralDiarrheaVirus ZHANG Shu—qin，TAN Bin，LIPeng，YANGYong，SUN Na， WANGFeng—xue，GUOLi，WENYong—jun，CHENGShi—peng※ (StateKey!,qhoratoryforMolecularBiologyofSpecialEconomicAnimals，InstituteofSpecialWild EconomicAnimalsandPlants，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Changchun130112，China) Abstract：Inthisstuay，aSYBRGreenIReal—timePCRassayfordetectingbovineviraldiarrheavirus(BVDV)wasestablishedandtested thetissuesfromclinicaldiarrheaeattles．ApairofprimersWaSdesignedaceordingtothecon~rvedregionoftheBVDV5IYrRgeneandaplas— midcontainingthetargetgenewasconslructedf1．sastandardcontro1．Theassayhadadetectionlimitof4．1X10eopies／N,viralRNA．which was100timesmolesensitivethantheconventionalPCR．ItWaShighlyspecificandnOcr088一llPAtetionswerefoundwithCSFVandotherbovine pathogensincludingIBRV，BRSV，BPI3V．ThisassaywasusedtodetecttheBVDV distribution inthetissuesamplesofthecattleinfected BVDV．Theresultsshowedthatthethymushadthehighestvirusload．ThehJghsensitivityandspecificityoftheassay，coupledwitharelatively rapidandsimpleprocedure．indicatedthattheReal—timePCR couldbeusedasaroutineassay． Keywords：bovineviraldiarrheavirus；detection；Real—timePCR 牛