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实验2 动物细胞染色体荧光原位杂交 实验目的： 使学生掌握染色体荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH) 分析技术，了解染色体荧光原位杂交分析技术的应用价值。 实验原理： FISHfluorescence in situ hybridization）技术是一种重要的非放射性原位杂交技术基本原理是被检测的染色体上的靶DNA与所用的核酸探针（probes）同源互补，经变性退火复性，形成靶DNA与核酸探针的杂交体。核酸探针标记上报告分子如生物素、地高辛，报告分子与荧光素标记的特异亲和素免疫化学反应经荧光对DNA进行定性、定量或相对定位分析。 图22-1 （From: ） FISH是目前进行细胞遗传学研究最为有效的手段，不仅可以研究分析染色体减数分裂过程的行为和不同基因组染色体交叉互换的现象，也是研究基因组分化的重要工具，甚至可以筛选出染色体标记的种特异性重复序列。FISH为研究染色体上DNA的序列提供了一个最直接的方法。具有经济、安全、快速、稳定，灵敏度高等优点FISH中使用的探针1）基因组探针（genomic probe）：人类基因组内一些高频率的重复序列，在进化上很少具有保守性。若以基因组DNA作为探针，这些存在于探针和靶细胞中的高度重复序列之间会首先退火结合，越过那些保守的和单一的序列，故杂交会呈现出种特异性。Centromere repeats ）、端粒重复（Telomere repeats）、核糖体DNA（Ribosomal DNA，rDNA）、Interspersed repetitive elements (SINEs, LINEs)等（图22-3、4）。 （2）染色体特异性序列探针（probe recognizing chromosome specific sequences)：目前在人几乎所有染色体中已经克隆出一些重复序列，重复一百到五千次不等，各具染色体特异性。大多在某一染色体的着丝粒区或异染色质区产生致密的杂交带。从而可特异性地识别某一染色体。3）染色体文库探针（chromosome labraries probe）：染色体文库收集人类单条染色体的DNA作为探针，又称整体染色体探针。单条染色体的获得一般有两种方法：来自仅携有某一条人类染色体的体细胞杂交株，或经流式细胞分类仪从染色体悬液中分离。4）单一序列探针（single-copy sequences probe）：FISH有一弱点，就是要求探针足够大，探针越小，杂交位点检出率就越低。欲利用FISH检测存在基因组内的单一序列基因，最有效的方法是应用含大插入片段的克隆载体，如全Cosmids（载约40kb的插入片段），更大的YAC载体（载100-800kb插入片段）。若掌握好，小到2kb的质粒探针亦可用FISH方法定位，但效率较低。 图22-2 （From：） 24色mFISHMulticolor FISH）核型分析技术是近年建立的一种新技术。其原理是使用5种荧光染料按比例标记探针，杂交后形成24条染色体各自呈现特异的荧光色彩以供核型分析图。为研究人员提供了更丰富详尽的细胞遗传学信息，包括确定标记染色体的来源、检测微小的染色体易位和检测复杂的染色体易位，尤其为肿瘤细胞染色体分析提供了全新、高效的方法。FISH的应用(1)基因定位与基因制图（gene mapping）。FISH已经极大地加速了人类基因定位和基因制图的进程。(2)基因诊断(gene diagnosis)精确、直观、明了(3)间期细胞遗传学（interphase cytogenetics）(4)FISH在肿瘤生物学中的应用肿瘤细胞遗传学（onco-cytogenetics）；基因定位：FISH可用于分离出的癌基因与抑癌基因初步定位；病毒基因插入基因组部分的检测利用FISH可以检测到病毒整合到人基因组中的情况，对深入研究病毒致癌机理，以及检测、防治肿瘤均具有重要意义；基因的扩增与缺失：原癌基因的激活与抑癌基因的失活是目前肿瘤研究的热点。已知原癌基因的激活方式有：突变、基因扩增、易位、病毒序列插入。抑癌基因的失活方式有：点突变、基因缺失。FISH为研究基因的扩增和缺失提供了新的方法，能将基因扩增和染色体重复分开。 图22-3 Telomeres FISH（From：/biology） 图22-4 FISH with repetitive probes to human chromosomes. (a) FISH with a pan-centromeric probe delineates all centromeres.(b) A probe containing the highly conserved repetitive seque