人肝再生增强因子在毕赤酵母中的表达、纯化和生物学活性的研究.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００７，２７（６）：２２～２６ 人肝再生增强因子在毕赤酵母中的表达、 纯化和生物学活性的研究 １，２ １ １ １ １ ２ 陈俊杰 　孔祥平 　佟明华 　李茹冰 　杨联萍 　游　松 （１解放军４５８医院全军肝病中心　广州　５１０６００　２沈阳药科大学制药工程学院　沈阳　１１００１６） 摘要　肝再生增强因子（ＡＬＲ）是一类胞源性肝细胞生长因子。为在毕赤酵母中分泌表达人肝再 生增强因子（ｒｈＡＬＲ），以色谱法分离纯化后进行体外活性研究，构建表达载体ｐＰＩＣＺＡＡＬＲ，经 α ? 电穿孔转入毕赤酵母中，用０．５％甲醇诱导表达；重组酵母培养上清经ＳＤＳＰＡＧＥ电泳和ｗｅｓｔｅｒｎ ? ｂｌｏｔ鉴定后表明，ｒｈＡＬＲ以分子量为３０ｋＤａ的二聚体为主；定量分析结果表明，重组酵母培养上 清中ｒｈＡＬＲ约占总蛋白的６６％，表达量约为４０ｍｇ／Ｌ；经ＤＥＡＥ柱和Ｇ７５柱纯化后，获得的ｒｈＡＬＲ 纯度大于９５％，得率为５２％；体外生物学活性实验表明，ｒｈＡＬＲ能明显促进ＨｅｐＧ２、ＳＭＭＣ７７２１和 ? ＮＩＨ３Ｔ３细胞的增殖。 ? 关键词　肝再生增强因子　毕赤酵母　分泌表达　分离纯化　生物学活性 中图分类号　Ｑ８１２ ［１］ 　　１９９４年 Ｈａｇｉｙａ等 从初断乳的大鼠肝胞液中分 分子量标准等购自ＴａＫａＲａ公司。ＤＥＡＥＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ ? 离出一种能促进肝细胞增殖，类似于肝刺激物（ｈｅｐａｔｉｃ 凝胶、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ７５凝胶，购自瑞典Ｐｈａｒｍａｃｉａ公司。 ? ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｓｕｂｓｔａｎｃｅ，ＨＳＳ）的热稳定性细胞因子，命名为 １．２　重组载体的构建 肝细胞再生增强因子（ａｕｇｍｅｎｔｅｒｏｆｌｉｖｅｒｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ， 　　根据ＡＬＲ序列设计上游引物Ｐ１、下游引物Ｐ２。 ＡＬＲ），并对其进行了克隆和纯化。在随后的研究中人 　　Ｐ１：５′＞ＣＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＣＧＧＡＣＧＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＧ＜３′ 们发现，ＡＬＲ不但能促进肝细胞增殖，还能保护肝 　　Ｐ２：５′＞ＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＧＴＣＡＣＡＧＧＡＧＣＣＡＴＣＣ ［２］ ［３］ 脏 ，预防肝纤维化 ，并能用于糖尿病的辅助治 ＴＴＣ＜３′ ［４］ 疗 ，这使它有望成为一种潜在的药物。本实验采用 　　以ｐＢＶ２２０ ＡＬＲ质粒为模板进行 ＰＣＲ扩增，用 ? 毕赤酵母系统，以分泌方式表达ｒｈＡＬＲ，通过色谱法分 ＰＣＲ小量回收试剂盒回收目的条带。回收的ＡＬＲ基因 离纯化获得高纯度 ｒｈＡＬＲ，并对 ｒｈＡＬＲ生物学活性进 和质粒ｐＰＩＣＺ Ａ分别用ＥｃｏＲ 、Ｎｏｔ 双酶切后，琼脂 α? Ⅰ Ⅰ 行了初步研究。 糖电泳回收并连接过夜。连接产物