AFLP─一种DNA分子标记新技术AFLP-ANovelTechniqueforDNAMolecularMarker.pdfVIP

遗传 HEREDITAS(Beijing)18(6):29-311996 综 述 AFLP— 一种DNA分子标记新技术 翁 跃 进 中（国农科院作物品种资像研究所，北京 100081) AFLP— ANovelTechniqueforDNAMolecularMarker WengYuejin (instituteofCropGermplasmResources,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100081) AFLP(Amplifiedfragmentlengthpolymorphism）国内译为扩增片段长度多态性，是 1993年由荷兰Keygene 公司科学家ZabeauMare和VosPieter发明创建的一种DNA分子标记新技术．它不仅具备了其它DNA分子标 记技术所具有的特点，多态性丰富，共显性表达，不受环境影响，无复等位效应，而且还具有带纹丰富，用样量 少，灵敏度高，快速高效等特殊优点．一个0.5mgDNA样品，可做4000个反应，获得8万个标记，650万条 带纹。美国加利福尼亚大学MackillDavidt;利用14份水稻为材料，比较AFLP和RAPD两种分子标记的实验 结果，发现RAPD方法21个引物获得 103条带纹．43个标记，而AFLP方法 18个引物获得了529条带纹， 147个标记．通过一些实验室和科学家的使用和验证，AFLP被认为是一种十分理想的、有效的、先进的分子标 记 （卜，，’〕．目前．不仅在小麦、水稻、玉米、大豆和棉花等主要农作物上得以应用，而且在蔬莱 番（茄、马铃 薯、鹰嘴豆）、林木 垂（枝桦Belulapendula,辐射松Pinusradiala)以及杭物基因组研究的模式植物拟南芥上广 泛应用 ． 1原 理 AFLP的原理是基于对植物基因组总DNA双酶切经PCR扩增后的限制性片段进行选择．’（，…’。）．具体是 植物基因组DNA经限制性内切酶双酶切后，形成分子量大小不等的随机限制性片段．将特定的接头a（dapter)连 接在这些DNA片段的两端，形成一个带接头的特异片段，通过接头序列和PCR引物3末端的识别，特异性片 段经变性，淬火和延仲周期性循环而扩增，最终通过聚丙烯酸胺凝胶电泳分子筛的作用，将这些特异的限制性片 段分离开来． 2流 程 AFLP流程包括模板准备、片段扩增和凝胶分析这3个主要步骤，，〔’，：’。，，各步骤具休的过程有：(1)提取 样本的DNA经浓度和质量检测后，针对杭物基因组常含AT的特点选择6个碱基识别位点的限制性内切酶，通 常是EcoRI或PSIT或Sad．和4个碱基识别位点的限制性内切酶，通常是Msel或Ssel在适宜的缓冲系统中进 行酶切．(2)酶切后的限制性片段在T4连接酶的作用下与特定的接头相连接，形成带有接头的特异性片段．(3) 利用磁珠粉（）在STEX盐溶液中反复洗脱2-3次，选择带有特定接头的限制性片段．(4)PCR前扩增．(5)利用 同位素32P或33P标定PCR引物．(6)在Taq聚合酶的作用下，完成94r-变性30秒－-65C1淬火30秒一72℃延仲 60秒PCR扩增36个循环．(7)PCR产物变性后在含尿素的聚丙烯Ift胺变性胶上电泳．(A)将电泳后的凝胶转移 30 遗 传 HEREDTTAS(Beijing)1996 18卷 吸附到滤纸上，经干胶仪进行干胶处理．(9)在X光片上感光，数 日后冲洗胶片并进行结果分析． 3应 用 AFLP和其它DNA分子标记技术一样．在遗传学和育种学领域具有广泛的应用前景．目前由于AFLP技 术比较新颖，又受到专利保护 欧（洲专利号EP0534858A1)，所以，其应用仅仅局限于荷兰、美国、德国和英 国等少数发达国家的科研单位和高等学府从事非盈利性的研究，其范围包括： 3.1遗传多样性的研究 美国康耐尔大学的Blair(s〕利用AFLP技术评价54份水稻品种的遗传多样性、研究其系统发育和分类．并 与同功酶生化标记及RFLP标记比较，发现不仅其结论一致，而且认为AFLP对于研究水稻品种的遗传变异和 构建基因组图谱更为理想．英国剑桥实验室中国