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引物设计实例分析 引物设计基本原则 引物长度（primer length） 产物长度（product length） 序列Tm值 (melting temperature) G+C含量（composition） 引物二聚体及发夹结构 （duplex formation and hairpin） 阅读框 2.扩增片段的长度 扩增片段长度在普通PCR以200～500为宜；实时荧光PCR则为50～150bp。 3. 引物溶解温度（Tm值） 引物的Tm值一般控制在55-60度, 尽可能保证上下游引物的Tm值一致,一般不超过2度. 如果引物中的G+C含量相对偏低,则可以使引物长度稍长,而保证一定的退火温度. Tm=2(A+T)+4(C+G) 引物要求 PCR扩增GFP GFP两边添加BamHI酶切位点 保证NR1的阅读框不改变 第二步：GC比值；Tm值 第三步：酶切位点 第五步 保护序列 不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目有要求 第五步 保护序列 Primer1: 5’ GCGGggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGA Primer2: 5’ GCGCggatccctCTTGTACAGCTCGTCCATGCC * * 1. 引物的长度 一般为18-30bp，常用的是20bp左右，但不能大于38bp，因为过长会导致其延伸温度大于72℃，即Taq酶的最适温度 4. 引物的GC含量 有效引物中(G+C)的比例为40-60%，过高（非特异性扩增0或过低（扩增效率不高）都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 5. 引物自身 引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败; 引物 3’端碱基，最好为G或C，形成GC夹子，提高引发效率，并提高扩增的特异性 任务 用绿色荧光蛋白(GFP)标记蛋白NR1 SP pcDNA3.1 NR1 Plasmid 1: Plasmid 2 GFP SP BamHI pcDNA3.1 NR1 Plasmid 1: Plasmid 2 GFP SP BamHI(GGATCC) pcDNA3.1 NR1-1a GFP 121 ggggctccta gagaacccgg gggcgcttga ccgcgcgcgg gcggcccgcg ggtcgtacat 181 cgcgaggtcg tcgcactcgc gcaacccaga gccaggcccg ctgtgcccgg agctcatgag 241 caccatgcac ctgctgacat tcgccctgct tttttcctgc tccttcgcc c gcgcggatcc 301 cgaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgtt 361 ccgcgaggca gtaaaccagg ccaataagcg acacggctct tggaagatac agctcaacgc 421 cacttctgtc acccacaagc ccaacgccat acagatggcc ctgtcagtgt gtgaggacct 481 catctctagc caggtctacg ctatcctagt tagccacccg cctactccca acgaccactt 541 cactcccacc cctgtctcct acacagctgg cttctacaga atccctgtcc tgggactgac 601 tacccgaatg tccatctact ctgacaagag tatccacctg agtttccttc gcacggtgcc 661 gccctactcc caccagtcca gcgtctggtt tgagatgatg cgagtctaca actggaacca 721 catcatcctg ctggtcagcg acgaccacga gggacgggca gcgcagaagc gcttggagac 781 gttgctggag gaacgggagt ccaaggcaga gaaggtgctg cagtttgacc caggaaccaa NR1的编码序列(~4000bp) 红色为信号肽, 蓝色为BamHI酶切位点, 下划线标出酶切位点的阅读框 ATGGTGAGCAAG GGCGAGGA