多聚物PVP介导免疫基因B一H3治疗小鼠肝癌的实验探讨7.pdfVIP

第29卷 第5期 黑龙江医药科学 VO1．29No．5 2006年 10月 HEILONGrjIANG MEDICINEANDPHARMACY Oct． 2006 ·1 · 多聚物PVP介导免疫基因B7一H3治疗小鼠肝癌的实验探讨 罗丽琼 (深圳市龙华医院妇产科 ，广东 深圳 518109) 摘要 ：目的：探讨 B7一H3基gl对肝癌 的治疗作用及其作用机制。方法：皮下种植法建立肿瘤模 型，以聚 乙烯吡咯烷酮 (PVP)为栽体，时荷肝癌小鼠行瘤体 内注射携带B7--H3基gl的真核表达质粒pcDNA3．1(+)一mB7--H3，检测治疗后小鼠体 内mB7--H3基因的表达、小鼠血清中IFN一7表达量、脾脏的细胞毒性T淋巴细胞 (cytotoxictlymphoctye，CTL)活性、肿瘤的 大小、肿瘤局部的淋 巴细胞浸润情况及荷瘤小鼠的生存期。结果：经roB7--H3基 因治疗后 ，治疗组小鼠血清中IFN一7表达量 和脾脏的CTL活性 明显增强 (P 0．01)，肿瘤局部淋巴细胞浸润明显，肿瘤生长受到抑制 ，荷瘤小鼠的存活期明显延长。结 论 ；B7一H3基 因有效地调动宿主抗肝癌 的免疫反应 。 关键词 ：B7一H3；肝肿瘤 ；基 因治疗 ；PVP 中图分类号 ：R735．7 文献标识码 ：A 文章编号 ：1008—0104(2006)05—0001一O3 本实验首次观察 了B7一H3基因治疗对荷肝癌小 鼠免疫 1．5 免疫 印记检测 (westernblotting) 功能及种植瘤生长的影响，了解 B7一H3基因的抗肿瘤作用 方法如参考文献 ，做简单改动 ，简述如下 ：基 因转染 3d 发机制 。 后 ，取出肿瘤 ，制成肿瘤组织匀浆 ，离心 10min，取上清液。用 1 材料与方法 10％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋 白，将胶上的蛋 白电转 1．1 实验动物及细胞 移至NC膜上 ，5％脱脂奶粉封闭，加入单克隆抗体兔抗 鼠一 balb／c小 鼠(由哈尔滨医科大学实验动物 中心提供)，雌 Flag(Sigma)·37C孵育 ，PBST洗膜 ，加入辣根过氧化物酶标 雄兼用 ，6～8周龄 ，16～20g，每个实验组性别一致 ，随机分 记抗体 (北京中山)，同样孵育洗膜 。最后硫酸镍铵增强法 组，每组至少5只小 鼠。H22肝癌细胞 (来 自黑龙江省肿瘤医 (O．O6 DAB，2．5 硫酸镍铵 ，0．Imol／L 乙酸钠 ，0．03％ 院动物实验 中心)，小 鼠腹水传代 。 HzOz)显色。 1．2 pcDNA3．1一Fag—mB7--H3／PVP的制备及转染 1．6 小鼠血清 IFN一7水平的测定 小 鼠的B7一H3的真核表达质粒 pcDNA3．1一Flag一 治疗结束后第3天 ．取小 鼠血清适当稀释(5倍)，利用双 mB7一H3及聚乙烯吡咯烷酮 (PVP，KDa50)由孙学英博士 抗体夹心ELISA法 (试剂盒购于博士德)测定血清 内IFN一7 (新西兰澳克兰大学)惠赠 。由于 目前没有可利用的抗roB7一 浓度。参见引文 。 H3抗体，所以构建了pcDNA3．1一 Flag—mB7--H3，将标记 1．7 荷瘤小鼠脾脏细胞毒性T淋巴细胞 (CTL)活性检测 蛋 白Flag加于B7--H3蛋 白的N末端 ，以便检测mB7--H3基 治疗结束后第 3天，取小 鼠脾脏 (每组5只)制成脾淋巴 因的表达 。质粒 以碱裂解法大量制备，PEG沉淀法纯化 ，其A 细胞悬液 ，将其与灭活的H22细胞 以2O：1比例置于含 10 值介 于 1．6～ 1．8，临用前将 质粒用 5 PVP和 150mmol／ FBS的 1640培养液 中，脾淋 巴细胞浓度为 1．8x1O／mL，同 LNaC1调整浓度至1g／L，质粒与PVP的质量 比为1