实验19植物基因组DNA及总RNA提取技术.pdfVIP

实验19 植物基因组DNA 及总RNA 提取技术 幼嫩组织的细胞处于旺盛的分裂阶段，核较大而胞质较少，核酸浓度高，且内含物少、 次生代谢产物少，蛋白质及多糖类物质相对较少，在SDS 或 CTAB 物质存在时，经机械研 磨，使细胞破裂并释放出内含物，提取的DNA 、RNA 的产量高，纯度好。 提取DNA 所用的提取液、吸头、离心管等需要高压灭菌以灭活DNase 。RNase 存在于 所有的生物中，并且耐沸腾、蒸煮，所以在提取RNA 的过程中要防止RNA 酶污染，用具 如吸头、离心管、水、药品等都要经RNase 的抑制剂DEPC 处理，即每100mL 溶液中加入 0.1～0.2 mL DEPC 溶液，37℃过夜，然后高压灭菌20 min 以灭活DEPC 。由于RNA 容易降 解，所有的提取步骤都在冰浴中进行。 DNA （RNA ）定量分析可用紫外光谱分析，原理是DNA （RNA ）分子在260 nm 处有 特异的紫外吸收峰，且吸收强度与 DNA(RNA) 的浓度成正比。此外，还可通过琼脂糖凝胶 电泳上显示的DNA（RNA ）带的亮度来分析，因为EB 作为一种荧光染料，能插入DNA(RNA) 的碱基对平面之间而结合于其上，在紫外光的激发下产生荧光，DNA(RNA)分子上EB 的量 与DNA 分子的长度和数量成正比。在电泳时加入已知浓度的DNA （RNA ）Marker 作为DNA （RNA ）分子量及浓度的参考，样品DNA(RNA) 的荧光强度就可以大致表示DNA （RNA ） 量的多少。这种方法的优点是简便易行，可结合琼脂糖凝胶电泳分析 DNA(RNA)样品的完 整性来进行，缺点是不太准确。 本实验介绍植物DNA 、RNA 提取及检测的方法步骤。 一、试材及用具 试材:植物幼嫩组织（如幼叶、花器、幼根）。 仪器、用具:离心机、离心管、紫外分光光度计、微量移液器、吸头、吸水纸、水浴锅、 冰箱、研钵、液氮罐、电子天平、pH 计、高压灭菌锅、一次性手套和口罩、电泳仪、电泳 槽等。 需配置的药品和缓冲液: 提取DNA缓冲液（CTAB法）: 2% CTAB(W/V),100 mmol/L Tris-HCI pH 8.0, 20 mmol/L EDTA pH 8.0, 1.4 mol ·L-1 NaCl ，2% PVP (灭菌后加入2% PVP ，使之充分溶解）。在研磨 叶片前加入1% （V/V ）ß-巯基乙醇。 CTAB提取RNA缓冲液为：2% CTAB(W/V) ，2% PVP(W/V) ，25 mmol/L EDTA ，100 mmol ·L-1 Tris-Cl pH 8.0 ，2.0 mol·L-1 NaCl ， 0.5 g ·L-1 Spermidine （亚精胺）。灭菌后加入 2% （V/V ）ß-巯基乙醇。 SSTE buffer 为：1.0 mol/L NaCl，0.5%SDS，10 mmol/LTris-Cl pH 8.0，1 mmol/L EDTA。 TE(pH 8.0): 称取1.211 g Tris、0.372 g EDTA-Na2 ，先用800 mL蒸馏水加热搅拌溶解， 用盐酸调pH 8.0 ，再用蒸馏水定容至1000 mL。高压灭菌20 min 。 氯仿/异戊醇（24:1,v/v ）: 将氯仿和异戊醇按体积 24:1 的比例混匀，置棕色瓶中，4 ℃ 保存。 酚: 氯仿:异戊醇(25:24:1):按饱和酚、氯仿、异戊醇体积比为25:24:1 比例混匀，置棕色 瓶中，4 ℃保存。 5× RNA 电泳缓冲液的配制：依次加入以下成分: 10.46 g MOPS 、1.7 g 乙酸钠，0.93 g EDTA ，调pH 7.0 ，定容到500 mL 。 RNA 加样缓冲液:1 mmol/L EDTA pH 8.0、0.25% 溴酚蓝、0.25%二甲苯青、50%甘油， 高压灭菌。 二、方法步骤 （一）植物基因组DNA 提取 在提取过程中用到的吸头、研钵、提取缓冲液等先高压灭菌20 min ，取出后待用，按照 下述步骤提取基因组DNA 。 （1）在65°C 水浴中预热CTAB 提取液。 （2 ）在液氮中研磨2～3