表达性载体pGEX-6p-1-hri的构建和人核糖核酸酶抑制因子对BALB%2fc小鼠的抗氧化保护作用.pdf

l的构建和人核糖核酸酶抑 表达性载体pGEX-6p-1-hr 制因子对BALB／c小鼠的抗氧化保护作用 硕士研究生： 杨明洁 指导教师： 崔秀云 教授 指导小组： 田余祥 副教授 专业名称： 生物化学与分子生物学 摘 要 Ribonuclease 背景介绍：人核糖核酸酶抑制因子【1】(HumaIl Inhibitor． hRI)是广泛存在于哺乳动物细胞浆中的一种酸性糖蛋白，分子量为 包含15个亮氨酸重复序列(Leucine．rich repem，LRP)131，而且一分子 的hRl含有32个高度保守的半胱氨酸残基，其中至少30个半胱氨酸 的巯基以还原型巯基的形式存在，还原型巯基是保持Ⅺ正常生物学活 性所必需的。生物体内的还原性谷胱甘肽(GsH)通过其巯基可清除 过氧化氢，防止脂质过氧化物造成的损害，在机体抗过氧化损伤方面 发挥了重要作用。我们实验室在关于hRI的抗氧化能力方面已经进行 了部分体外实验，在细胞水平证实能够过表达hRI的大鼠神经胶质瘤 C6细胞在过氧化氢(H202)损伤时，不仅在细胞形态，而且在LDH 漏出水平，MDA和GSH含量方面都较对照组表现了较强的抗氧化损 伤的能力【4】。因此，我们推测hRl在提高机体抗氧化损伤方面具有一定 的潜力。 目的：从组织中提取的该蛋白产量较少，成本高，不宜大批量生 产，所以本室一直研究其基因工程生产的方法。探索最优条件下融合 蛋白GST。hRI的可溶性表达。 ·1‘ 入到标签蛋白GST之后。调整诱导剂IPTG的浓度和诱导温度以期望 得到目的融合蛋白的最大可溶性表达。将多次培养的菌体收集，经超 声破碎，收集离心后的上清，由亲和层析柱RNase 4B分 A．Sepharose 保护七天后，腹腔注射四氯化碳(CCl。)造成急性肝损伤模型[61。检测 指标，并在光镜下检测肝细胞的损伤程度。评估该融合蛋白对小鼠肝 脏的抗氧化保护作用。 结果：0．5mmol／L IPTG，26℃诱导表达8小时，超声破碎菌体所 得到的上清中可溶性hRI的表达量最理想，约占超声后离心上清总蛋 白4．5％，上清中的hRI含量与沉淀中的比例约为27％。治疗组的血液 和肝脏生化指标水平优于四氯化碳完全损伤组。 GST．RI融合蛋白腹腔注射可以对急性四氯化碳 结论：100u／Kg．d 损伤的小鼠肝脏提供有效地保护，其保护效力与500mg／Kg．d维生索C 相当。经统计学检验，血清和肝脏的各项生化指标(ALT、AST水平和 完全损伤组，而且维生素C组和GST-RI组的保护作用优于刚组。说 明融合蛋白GST．RI的抗氧化能力优于非融合蛋白，N端的标签蛋白没 有影响hRI的活性。该体内实验为将来针对氧应激相关的多种疾病， 如动脉粥样硬化、老年痴呆、缺血再灌的含hRI．GST序列的基因治疗 提供了蛋白质水平的直接证据。 关键词：核糖核酸酶抑制因子 融合蛋白 四氯化碳 急性肝损伤 ·2· ofFusion Plasmid Construction Expressive and of Oxidativeresistance