水产品中副溶血性弧菌ELISA快速检测.pdf

上海水产大学硕十论文 LI 水产品中副溶血性弧菌的E sA快速检测 摘要 细菌性食物中毒是影响我国食品安全的一个非常重要的因素。副溶血性弧菌 是引起食物中毒的主要病原菌之一，每年夏秋季是副溶血性弧菌最适生长季节， 也是其引起食物中毒的高峰期。人如误食染有此菌的水产品，很容易被感染，潜 伏期一般2～26h，主要症状有腹痛、腹泻、呕吐和发烧等，水样粪便，少数呈 血水样或粘液血便，严重的可能会危机生命11J。 本文通过制备副溶血性弧菌抗原，免疫新西兰大白兔获得效价高、特异性强 的多克隆抗体，并利用此抗体进行间接ELISA试验，筛选出最适反应条件，建 立了副溶血性弧菌间接ELISA检测法。此法具有检测时间短、特异性强、准确 度高等优点，为食品中特别是水产品中副溶血性弧菌的检测提供快速准确的检测 方法，并为食品中副溶血性弧菌的EL|SA快速检测试剂盒的研制提供科学依据， 也为副溶血性弧菌双抗体夹心ELISA检测法的建立提供理论依据，因此本实验 具有很高的实际意义。 本课题主要从以下几方面进行了研究： 1 副溶血弧菌抗原和抗体的制备 本实验结合甲醛和热灭活法筛选出副溶血性弧菌最佳灭活条件：用0．05％ (V／V)的甲醛、30℃条件下灭活副溶血弧菌4h制备抗原，并以此抗原分多次， 剂量递增，免疫新西兰大白兔获得特异性多克隆抗体，以山羊抗兔IgG．HRP作 为酶标二抗，通过间接ELISA法测定其多克隆抗体的效价、敏感性和特异性。 结果表明：在免疫的第5周产生大量高效价抗体，效价最高可达1．6x105；此多 克隆抗体对副溶血弧菌检测灵敏度为lxl04cfu／mL；交叉反应和阻断试验结果显 示此多克隆抗体具有很强的特异性，与鳗弧菌、溶藻弧菌、沙门氏菌等多种菌株 均无交叉反应，因此可为间接ELISA检测法的建立、试剂盒的研制提供优质的 多克隆抗体，为后续工作奠定基础。 2 间接ELISA检测法的建立 本文通过筛选试验，确定各检测步骤的最适合反应条件，并用棋盘滴定法抗 原与抗体的最佳工作浓度，此法标准化后，其检测参数为：采用新的抗原包被法， 60℃烘干包被，抗原包被浓度为107cfu／mL；封闭时间为2．5h；一抗工作稀释度 上海水产大学硕士论文 与酶标二抗孵育时间为60rain；酶与底物反应温度为30℃，时间为15min：孵育 cfu／mL； 温度为37℃：运用此法对副溶血性弧菌菌悬液进行检测，检测阈为104 检测时间为8h。 3 间接ELISA快速检测水产品中副溶血性弧菌 以此多克隆抗体作为一抗，山羊抗兔IgG．HRP作为酶标二抗，建立副溶血 弧菌的间接ELISA快速检测法。将该方法标准化后进行检测实验，交叉实验表 明，此多克隆抗体与其它菌株交叉反应结果为阴性；阻断实验表明其具有较高的 特异性，阻断率高达86．53％。运用此方法分别对人工染菌水产品及实际水产品 进行检测，检测下限为104cfu／ml，检测时问为8h：而将样品经过8h增菌培养后， 检测下限可提高到103cfidml。运用此法与常规方法分别对人工染菌水产品及实 际水产品进行检测，其检测结果完全一致，因此本法可为检测水产品中副溶血性 弧菌提供准确、快速的方法，具有很高的应用价值。 4 水产品中副溶血性弧菌问接ELISA快速检测试剂盒的初步研制 提出了水产品中副溶血性弧菌ELISA快速检测试剂盒的组成部件，使用说 明，操作注意事项。并对本试剂盒各组分的保存期，试剂盒的稳定性、灵敏度、 以及特异性进行了评价实验，结果表明本试剂盒可在4℃环境中，保存时间是3 个月以上，具有良好的稳定性。可在8h内检测出104cfu／ml浓度的副溶血性弧菌， 经8h增菌培养后，其检测下限可提高到103cfu／ml。并且起其他菌株无交叉反应。 因此，本试剂盒具有一定的应用价值。 关键词：副溶血性弧菌，EuSA，抗体，检测，试剂盒 2 上海水产大学硕十论文 ELISAMethodfor